Untersuchungen zur Infektionseffizienz der HIV-Vakzinekandidaten EHV-C und NYVAC-C in über Monozyten generierten dendritischen Zellen:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 AUSMASS UND FOLGEN VON HIV-EPIDEMIE UND AIDS 1
1.2 DIE BEDEUTUNG DER ENTWICKLUNG
EINES IMPFSTOFFS GEGEN HPV 2
1.3 EIN IMPFSTOFF GEGEN HTV-EINE GROSSE HERAUSFORDERUNG 3
1.3.1 PROBLEME BEI DER IMPFSTOFFENTWICKLUNG 3
1.3.2 UNTERSCHIEDLICHE VAKZINIERUNGSKONZEPTE 4
1.3.3 VIRALE VEKTOREN 4
1.4 EQUINES HERPESVIRUS 1 (EHV-1) 5
1.4.1 ALLGEMEINES 5
1.4.2 REPLIKATIONSZYKLUS UND GENEXPRESSION 5
1.5 NEW YORK VACCINIA VIRUS (NYVAC) 8
1.5.1 ALLGEMEINES 8
1.5.2 REPLIKATIONSZYKLUS UND GENEXPRESSION 8
1.6 DENDRITISCHE ZELLEN 10
1.7 ZIELSETZUNG 11
2 MATERIAL UND METHODEN 12
2.1 VAKZINEKANDIDATEN 12
2.1.1 EQUINES HERPESVIRUS-HIV-C 12
2.1.2 NEW YORK VAKZINIA VIRUS-HIV-C 12
2.2 KULTIVIERUNG VON HEK 293T-ZELLEN 13
2.3 GEWINNUNG VON PBMCS (PERIPHER BLOOD
MONONUCLEAR CELLS) AUS BUFFY COAT 13
2.4 GENERIEREN VON MDDCS (MONOCYTES DERIVED
DENDRITIC CELLS) AUS CD14
+
MONOZYTEN I 13
2.5 NACHWEIS DER EXPRESSION FRUEHER UND SPAETER GENE VON EHV-C UND
NYVAC-C 14
2.5.1 INFEKTION VON HEK 293T-ZELLEN UND MDDCS 14
2.5.2 RNA-ARBEITSTECHNIKEN 15
2.5.2.1 RNA-ISOLATION 15
2.5.2.2 UNTERSUCHUNG ISOLIERTER RNA BEZUEGLICH DNA-KONTAMINATION 16
2.5.2.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG ISOLIERTER RNA MITTELS
SPEKTRALPHOTOMETER 17
2.5.2.4 REVERSE TRANSKRIPTION 17
2.5.2.5 QUALITATIVE ANALYSE REVERS TRANSKRIBIERTER RNA 18
I
HTTP://D-NB.INFO/1047730731
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.3 QUANTIFIZIERUNG REVERS TRANSKRIBIERTER RNA MITTELS REAL-TIME PCR
18
2.5.3.1 PRINZIP DES LIGHTCYCLERS* UND DER SYBR* GREEN METHODE 18
2.5.3.2 SCHMELZKURVENANALYSE 19
2.5.3.3 AUSWAHL DER GEEIGNETEN PRIMER
FUER DIE REAL-TIME PCR 19
2.5.3.4 VORBEREITEN DER PROBEN UND WAHL DER GEEIGNETEN PCR-BEDINGUNGEN
21
2.5.3.5 ANALYSE MITTELS RELATIVER QUANTIFIZIERUNG 22
2.6 WESTERN-BLOT-ANALYSE 23
2.7 INFEKTION VON HEK 293T-ZELLEN UND MDDCS MIT FARBSTOFF MARKIERTEM
EHV-C
UND NYVAC-C 25
2.7.1 VERWENDUNG VON CFDA-SE ALS FARBSTOFF. 25
2.7.2 GENERIERUNG VON FARBSTOFF MARKIERTEM EHV-C UND NYVAC-C 26
2.7.3 NACHWEIS DER INFEKTION MIT CFDA-SE MARKIERTEM VIRUS IN DER FACS-
ANALYSE 27
2.7.4 NACHWEIS DER BILDUNG DES POLYPROTEINS GAGPOLNEF MITTELS
INTRAZELLULAERER
FACS-FAERBUNG 27
2.7.5 FLUORESZENZMIKROSKOPISCHER NACHWEIS DER INFEKTION MITTELS CFDA-SE
MARKIERTEN VIREN 28
3 ERGEBNISSE 29
3.1 AUSBEUTE VON IMMATUREN MDDCS NACH DEREN GENERIERUNG AUS CD14
+
MONOZYTEN 29
3.2 AUSSAEEN UND WACHSTUM VON HEK 293T-ZELLEN 29
3.3 NACHWEIS DER EXPRESSION FRUEHER UND SPAETER GENE VON EHV-C UND NYVAC-C
IN
MDDCS UND HEK 293T-ZELLEN MITTELS LIGHTCYCLER*-ANALYSE 30
3.3.1 RNA-ISOLATION AUS VIRUSINFIZIERTEN MDDCS UND HEK 293T-ZELLEN 4 HPI
UND
8 HPI MITTELS RNEASY-MINIKIT MIT DNASE-VERDAU UND REVERSE TRANSKRIPTION
IN CDNA 30
3.3.2 RNA-ISOLATION AUS HEK 293T-ZELLEN MITTELS RNEASY-MINIKIT MIT
DNASE-
VERDAU UNTER VERWENDUNG VON RNASE-INHIBITOR UND EDTA SOWIE REVERSE
TRANSKRIPTION IN CDNA 33
3.3.3 RNA-ISOLATION MITTELS TRI-REAGENT* AUS VIRUSINFIZIERTEN MDDCS UND
HEK 293T-ZELLEN 4 HPI UND 8 HPI MIT DNASE-VERDAU 35
3.3.4 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG ISOLIERTER RNA ZUR
BESTIMMUNG
DER AUSGANGSMENGE FUER DIE REVERSE TRANSKRIPTION 37
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.5 REVERSE TRANSKRIPTION DER MITTELS TRI-REAGENT* ISOLIERTEN RNA IN
CDNA 37
3.3.6 MITTELS LIGHTCYCLER* GEWONNENE DATEN ZUR BESTIMMUNG DER RELATIVEN
QUANTIFIZIERUNG FRUEHER UND SPAETER GENE VON EHV-C UND NYVAC-C 39
3.3.6.1 BESTIMMUNG DES CROSSING POINTS DER GENE GAG, F17R UND EICPO
WAEHREND
IHRER AMPLIFIKATION MITTELS LIGHTCYCLER* ZUR RELATIVEN QUANTIFIZIERUNG
39
3.3.6.2 ERMITTELN DER PCR-EFFIZIENZEN AUS DEN CROSSING POINTS UND DEN
CDNA-
KONZENTRATIONEN ZUR RELATIVEN QUANTIFIZIERUNG 43
3.3.6.3 EXEMPLARISCHE DARSTELLUNG DER SCHMELZKURVEN VON AMPLIFIZIERTEN
GENPRODUKTEN INFIZIERTER MDDCS UND HEK 293T-ZELLEN ANHAND DES GENS
GAG UND DARAUS ERMITTELTE SCHMELZPUNKTE
45
3.3.7 NACHWEIS UND VERGLEICH DER EXPRESSION FRUEHER UND SPAETER GENE
MITTELS
RELATIVER QUANTIFIZIERUNG 46
3.3.7.1 EXPRESSION DER FRUEHEN GENE IE UND EICPO UND
DES SPAETEN GENS GPD VON
EHV-C 47
3.3.7.2 EXPRESSION DES FRUEHEN GENS E3L UND DES SPAETEN GENS F17R VON
NYVAC-C 49
3.3.7.3 EXPRESSION DES GENS GAG VON HIV KODIERT VON EHV-C UND NYVAC-C 51
3.4 NACHWEIS DER BILDUNG DES GAGPOLNEF-POLYPROTEINS VON HIV IN EHV-C UND
NYVAC-C INFIZIERTEN MDDCS MITTELS WESTERN-BLOT-ANALYSE 52
3.5 NACHWEIS DER INFEKTION VON HEK 293T-ZELLEN UND MDDCS MITTELS
FARBSTOFF
MARKIERTEM EHV-C UND NYVAC-C 54
3.5.1 NACHWEIS DER INFEKTION MITTELS FLUORESZENZMIKROSKOPISCHER ANALYSEN
54
3.5.2 NACHWEIS DER INFEKTION MITTELS FACS-ANALYSE 55
4 DISKUSSION 58
4.1 VERGLEICH DER RNA-ISOLATIONSVERFAHREN MIT RNEASY-MINIKIT UND MIT
TRI-
REAGENT* IN KOMBINATION MIT RNEASY-MINIKIT 58
4.2 VERGLEICH UNTERSCHIEDLICHER DNASE-VERDAU-METHODEN 59
4.3 GEEIGNETE RNA-ISOLATIONSZEITPUNKTE FUER DIE FRUEHEN BEZIEHUNGSWEISE
SPAETEN GENE
VON EHV-C UND NYVAC-C 60
4.4 VERGLEICH DER EXPRESSION DER FRUEHEN UND SPAETEN GENE VON EHV-C MIT
DER
EXPRESSION DER FRUEHEN UND SPAETEN GENE VON NYVAC-C IN HEK 293T-ZELLEN 61
IN
INHALTSVERZEICHNIS
4.5 EXPRESSION DER FRUEHEN GENE IE, EICPO UND DES
SPAETEN GENS GPD VON EHV-C IN
MDDCS 62
4.6 EXPRESSION DES FRUEHEN GENS E3L, DES SPAETEN GENS F17R VON NYVAC-C
SOWIE
DES GENS GAG VON HIV KODIERT VON NYVAC-C IN MDDCS 62
I
4.7 NACHWEIS DER INFEKTION VON HEK 293T-ZELLEN UND MDDCS DURCH CFDA-SE
MARKIERTES EHV-C UND DURCH CFDA-SE MARKIERTES NYVAC-C 65
5 ZUSAMMENFASSUNG 67
6 AUSBLICK 69
7 ANHANG 70
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 75
9 LITERATURVERZEICHNIS 81
10 DANKSAGUNG 86
11 EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 87
IV
|
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