Entwicklung eines Systems zur Expression von membranständigen Dehydrogenasen aus einem Metagenom von Essigsäurebakterien in Gluconobacter oxydans:
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1.
STOFFWECHSEL VON G. OXYDANS ....2
1.1.1. ZENTRALSTOFFWECHSEL 3
1.1.2. ACETATSTOFFWECHSEL 3
1.1.3. MEMBRANSTAENDIGE DEHYDROGENASEN 5
1.2.METAGENOM VON ESSIGSAEUREBAKTERIEN 8
1.2.1. PRINZIPIELLE ANALYSE VON METAGENOMEN 9
1.2.2. EINE ESSIGMUTTER ALS QUELLE FUER EIN METAGENOM 10
1.2.3. GLUCONOBACTER OXYDANS ALS EXPRESSIONSSTAMM 11
1.3.ZIELSETZUNG DER ARBEIT 12
2. MATERIAL UND METHODEN 15
2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 15
2.1.1. CHEMIKALIEN 15
2.1.2. ISOLATION VON DNA 15
2.1.2.1. ISOLATION VON
GENOMISCHER DNA AUS
G. OXYDANS 15
2.1.2.2. ISOLATION VON PLASMIDEN AUS E. COLI 16
2.1.3. DNA-ANALYTIK 16
2.1.3.1. DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 16
2.1.3.2. ANALYTISCHE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 17
2.1.3.3. PRAEPARATIVE AGAROSEGELELEKTROPHORESE 17
2.1.3.4. DNA-DNA HYBRIDISIERUNG MITTELS SOUTHERN BLOT 18
2.1.3.5. DNA - SEQUENZIERUNG 21
2.1.4. ENZYMATISCHE MODIFIKATIONEN VON DNA 21
2.1.4.1. RESTRIKTIONSVERDAU 21
2.1.4.2. ALKALISCHER PHOSPHATASE VERDAU 22
2.1.4.3. LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 22
2.1.5. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 23
2.1.5.1. KONSTRUIERENDE PCR 23
2.1.5.2. KOLONIE-PCR * ! 24
2.1.5.3. LONG FLANKING HOMOLOGY (LFH)-PCR 25
2.2.MIKROBIOLOGISCHE ARBEITSMETHODEN 26
2.2.1. ORGANISMEN UND PLASMIDE 26
HTTP://D-NB.INFO/1048105679
N INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2. NAEHRMEDIEN 30
2.2.2.1. NAEHRMEDIUM FUER
G. OXYDANS 30
2.2.2.2. LURIA-BERTANI MEDIUM FUER E. COLI 30
2.2.2.3. MEDIENZUSAETZE 30
2.2.3. ZELLANZUCHT 31
2.2.3.1. ZELLANZUCHT VON G. OXYDANS 31
2.2.3.2. ZELLANZUCHT VON
E. COLI 31
2.2.4. STAMMHALTUNG UND REINHEITSKONTROLLEN 31
2.2.5. BESTIMMUNG DER OPTISCHEN DICHTE 32
2.2.6. TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN E. COLI 32
2.2.6.1. VORBEREITUNG VON
E. COLI ZELLEN FUER
DAS HITZESCHOCKVERFAHREN 32
2.2.6.2. TRANSFORMATION MITTELS HITZESCHOCK 32
2.2.7. KONJUGATION 33
2.2.8. DELETION VON GENEN IN G. OXYDANS MITTELS HOMOLOGER REKOMBINATION
34
2.2.9. INTEGRATION VON GENEN MITTELS HOMOLOGER REKOMBINATION 36
2.2.10.
WACHSTUMSEXPERIMENTE 37
2.2.10.1. WACHSTUM AUF VERSCHIEDENEN KOHLENSTOFFQUELLEN 37
2.2.10.2. WACHSTUMSKURVEN 38
2.3.
ANALYTIK 38
2.3.1. ENZYMATISCHE METABOLITKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 38
2.3.2. HPLC-ANALYTIK 38
2.3.3. ENZYMTEST ZUR MESSUNG DER AKTIVITAET MEMBRANSTAENDIGER
DEHYDROGENASEN MITTELS
AUFREINIGUNG DER MEMBRANFRAKTION 39
2.3.3.1. PRAEPARATION DER MEMBRANFRAKTION VON G. OXYDANS 39
2.3.3.2. AKTIVITAETSMESSUNG VON MEMBRANFRAKTIONEN MITTELS DCPIP-PMS-
REDUKTIONSVERFOLGUNG 40
2.3.4. TEST ZUR MESSUNG DER AKTIVITAET MEMBRANSTAENDIGER DEHYDROGENASEN IN
GANZEN
ZELLEN 40
2.3.4.1. VORBEREITUNG DER ZELLEN 41
2.3.4.2. MESSUNG DER DCPIP-PMS REDUKTION AN GANZEN ZELLEN 41
2.4.
ARBEITSMETHODEN ZUR METAGENOMBANKERSTELLUNG 41
2.4.1. KULTIVIERUNG EINER ESSIGMUTTER I 41
2.4.2. ISOLATION VON DNA AUS EINER ESSIGMUTTER 42
2.4.3. BESTIMMUNG DER DIVERSITAET 42
2.4.4. ERSTELLUNG UND SEQUENZIERUNG DER METAGENOMBANK 43
2.4.5. EXPRESSION VON MEMBRANSTAENDIGEN DEHYDROGENASEN 44
INHALTSVERZEICHNIS DI
2.5.
IN JI7/CO-TECHNIKEN 45
2.5.1. BLAST 46
2.5.2. PFAM-SCAN 46
2.5.3. PSORTB ! .....46
3. ERGEBNISSE 47
3.-L.DELETION ALLER MEMBRANSTAENDIGER DEHYDROGENASEN IN G. OXYDANS 621H
47
3.1.1. DELETION DER ALKOHOL-DEHYDROGENASE 47
3.1.2. DELETION DER INOSITOL-DEHYDROGENASE 49
3.1.3. DELETION DER ALDEHYD-DEHYDROGENASE 50
3.1.4. DELETION DER SORBITOL-DEHYDROGENASE 50
3.1.5. DELETION DER GLUCONAT-2-DEHYDROGENASE 51
3.1.6. DELETION DER GLUCOSE-DEHYDROGENASE 52
3.1.7. DELETION DER POLYOL-DEHYDROGENASE 53
3.1.8. DELETION DER PQQ-ABHAENGIGEN DEHYDROGENASE 2 55
3.1.9. DELETION DER PQQ-ABHAENGIGEN DEHYDROGENASE 3 57
3.1.
LO.DELETION DER PQQ-ABHAENGIGEN DEHYDROGENASE 4 58
3.1.11.DELETION DER MEMBRANSTAENDIGEN D-LACTAT-DEHYDROGENASE 59
3.1.12.DELETIONEN PUTATIVER MEMBRANSTAENDIGER L-LACTAT-DEHYDROGENASE 60
3.1.13.SUCHE NACH WEITEREN MEMBRANSTAENDIGEN DEHYDROGENASEN 62
3.2.
PHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DELETIONSMUTANTEN 63
3.2.1. WACHSTUMSEXPERIMENTE AUF VERSCHIEDENEN KOHLENSTOFFQUELLEN 64
3.2.1.1. WACHSTUMSVERHALTEN AUF FRUCTOSE 65
3.2.1.2. WACHSTUMSVERHALTEN AUF MANNITOL 67
3.2.1.3. WACHSTUMSVERHALTEN AUF GLUCOSE 68
3.2.1.4. VERGLEICH DER ERZEUGTEN METABOLITE 69
3.2.2. OXIDATIONSVERMOEGEN DER EINZELNEN DELETIONSMUTANTEN 70
3.2.2.1. ETABLIERUNG EINES GANZZELL-DCPIP-ASSAY 71
3.2.2.2. SUBSTRATSCREENING MIT DEM GANZZELL-DCPIP-ASSAY 72
3.2.2.3. VERGLEICH MIT EINEM KLASSISCHEN DCPIP-ASSAY 83
3.3.INTEGRATION VON MEMBRANSTAENDIGEN DEHYDROGENASEN IN DAS CHROMOSOM VON
G. OXYDANS 84
3.3.1. ERSTELLUNG DER INTEGRATIONMUTANTEN 84
3.3.1.1. INTEGRATION DER ALKOHOL-DEHYDROGENASE 85
3.3.1.2. INTEGRATION DER POLYOL-DEHYDROGENASE AN DIE
STELLE DER ALKOHOL-DEHYDROGENASE.....
85
3.3.2. PHYSIOLOGIE DER INTEGRATIONSMUTANTEN 86
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.1. PHYSIOLOGIE DER REINTEGRATIONSMUTANTE G. OXYDANS BP.9:ADH 86
3.3.2.2. PHYSIOLOGIE DER INTEGRATIONSMUTANTE
G. OXYDANS
BP.8.1 AMADH::SLDAB 87
3.4.DAS METAGENOM EINER ESSIGMUTTER 88
3.4.1. KULTIVIERUNG EINER ESSIGMUTTER UND ISOLATION DER DNA 88
3.4.2. UNTERSUCHUNG DER DIVERSITAET 91
3.4.3. ETABLIERUNG EINER INSILICO SCREENINGMETHODE FUER MEMBRANSTAENDIGE
DEHYDROGENASEN 94
3.5.EXPRESSION METAGENOMISCHER DEHYDROGENASEN IN G. OXYDANS 100
3.5.1. ERSTELLUNG DER EXPRESSIONSPLASMIDE 100
3.5.2. SUBSTRATSCREENING MIT GANZZELL-DCPEP-ASSAYS 100
3.5.2.1. OXIDATIONSAKTIVITAET VON
MMGDH 101
3.5.2.2. OXIDATIONSAKTIVITAET VON MPQQ4 102
3.5.2.3. OXIDATIONSAKTIVITAET VON
MSLDAB 102
3.5.2.4. OXIDATIONSAKTIVITAET VON MMADH 103
3.5.2.5. OXIDATIONSAKTIVITAET VON
MMACDH 105
3.5.2.6. OXIDATIONSAKTIVITAET VON MMDLDH 106
3.6.
UNTERSUCHUNG DES ACETATSTOFFWECHSELS IN G. OXYDANS 106
3.6.1. ERSTELLUNG DER DELETIONSMUTANTEN 106
3.6.1.1. DELETION DER PYRUVAT-DECARBOXYLASE 106
3.6.1.2. DELETION DER CYTOPLASMATISCHEN ACETALDEHYD-DEHYDROGENASEN
GOX1122 UND
GOX2018 : 107
3.6.1.3. DELETION DER ACETYL-COA-SYNTHETASE 108
3.6.2. PHYSIOLOGIE DER DELETIONSMUTANTEN 109
3.6.2.1. WACHSTUMSEXPERIMENTE 109
3.6.2.2. VERGLEICH DER METABOLITE 110
4. DISKUSSION 113
4.1.
MEMBRANSTAENDIGE DEHYDROGENASEN IN G. OXYDANS 621H 113
4.1.1. WACHSTUMSVERHALTEN DER DELETIONSSTAEMME 113
4.1.2. SUBSTRATSPEKTREN MEMBRANSTAENDIGER DEHYDROGENASEN 115
4.2.MEMBRANSTAENDIGE DEHYDROGENASEN AUS EINEM METAGENOM 124
4.2.1. DIVERSITAET EINES ESSIGMUTTERMETAGENOMS 124
4.2.2. SUBSTRATSPEKTREN DER METAGENOMISCHEN DEHYDROGENASEN 125
4.3.ACETATSTOFFWECHSEL VON G. OXYDANS 621H 134
5. ZUSAMMENFASSUNG 139
6. LITERATURVERZEICHNIS 141
INHALTSVERZEICHNIS
V
7. ANHANG 149
8. DANKSAGUNG 179
9. LEBENSLAUF 181
|
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