Regulation der ER-Translokation sekretorischer Proteine durch Sekundärstrukturelemente der Polypeptidkette:
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 7
1.1 IMPORT IN DAS ENDOPLASMATISCHE RETIKULUM 7
1.1.1 UEBERBLICK UEBER KO- UND POSTTRANSLATIONALE TRANSLOKATION 7
1.1.2 REGULATION DER KOTRANSLATIONALEN TRANSLOKATION 13
1.1.3 KONSERVIERUNG DES KOTRANSLATIONALEN TRANSPORTWEGES ZWISCHEN PRO-
UND.
EUKARYOTEN 17
1.2 QUALITAETSKONTROLLE IM ER 19
1.2.1 ER-ASSOZIIERTE DEGRADIERUNG (ERAD) 19
1.2.2 STRESSANTWORT AUF UNGEFALTETE PROTEINE (UPR) 21
1.3 NEUROPEPTIDE 22
1.3.1 FUNKTION DER ANALYSIERTEN PEPTIDHORMONE 22
1.3.2 BIOGENESE 23
1.3.3 FUNKTION DER PRODOMAENE 25
1.4 INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTE PROTEINE 26
1.4.1 DEFINITION 26
1.4.2 FUNKTION 27
1.4.3 IN SILICO VORHERSAGE VON INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTEN REGIONEN 30
1.5 MITOCHONDRIALE ZIELSTEUERUNG UND DUALES TARGETING 30
1.6 ZIELSETZUNG 35
2 ERGEBNISSE 37
2.1 INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTE PROTEINE SIND IM HUMANEN SEKRETOM
UNTERREPRAESENTIERT 37
2.2 DIE NEUROPEPTIDHORMONE TRH, SOMATOSTATIN UND GNRH WERDEN ALS
INTRINSISCH UNSTRUKTURIERT, IHRE PRODOMAENE ALS A-HELIKAL VORHERGESAGT 38
2.3 DIE ISOLIERTE PRODOMAENE VON SOMATOSTATIN BESITZT DIE FAEHIGKEIT ZUR
AUSBILDUNG EINER A-HELIKALEN STRUKTUR 40
2.4 EINE A-HELIKALE STRUKTUR DER PRODOMAENE BEGUENSTIGT DIE
ER-TRANSLOKATION 45
2.4.1 DIE DELETION DER PRODOMAENE FUEHRT ZU EINER VERRINGERTEN ODER
GEHEMMTEN
SEKRETION DER HORMONDOMAENE 45
1
HTTP://D-NB.INFO/1043875123
INHALTSVERZEICHNIS
2.4.2 EIN AUSTAUSCH DER PRODOMAENE DURCH HETEROLOGE ALPHA-HELIKALE
DOMAENEN
KANN DIE SEKRETIONSFOERDERNDE FUNKTION DER PRODOMAENE ERSETZEN 49
2.4.3 DIE PRODOMAENE IST FUER EINE ERFOLGREICHE ER-TRANSLOKATION
ERFORDERLICH 51
2.4.4 DIE KOTRANSLATIONALE ZIELSTEUERUNG UND BINDUNG AN DIE ER-MEMBRAN
WIRD
NICHT DURCH EINE INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTE RIBOSOMEN-ASSOZIIERTE
POLYPEPTIDKETTE
BEEINTRAECHTIGT 56
2.5 ER-SIGNALSEQUENZEN NICHT-TRANSLOZIERTER PROTEINE KOENNEN EINE
MITOCHONDRIALE ZIELSTEUERUNG VERMITTELN 62
2.5.1 DIE DELETION DER PRODOMAENE VON SOMATOSTATIN FUEHRT ZU EINER
MITOCHONDRIALEN LOKALISATION 62
2.5.2 MITOCHONDRIALE ZIELSTEUERUNG ALS FOLGE EINES GESCHEITERTEN
ER-IMPORTS ..64
2.5.3 SUCHE NACH EINEM MOTIF IN ER-SIGNALSEQUENZEN
MITOCHONDRIAL-LOKALISIERTER
MUTANTEN 66
2.6 INEFFIZIENTE PERIPLASMATISCHE LOKALISATION VON INTRINSISCH
UNSTRUKTURIERTEN
DOMAENEN IN PROKARYOTEN 71
3 DISKUSSION 75
3.1 UNTERREPRAESENTATION VON INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTEN PROTEINEN IM ER
-
EIN EVOLUTIONAER KONSERVIERTER MECHANISMUS? 75
3.2 ALPHA-HELIKALE PRODOMAENEN FOERDERN DIE ER-TRANSLOKATION VON
INTRINSISCH
UNSTRUKTURIERTEN NEUROPEPTIDHORMONEN 78
3.3 MOEGLICHER EINFLUSS VON C/S-FAKTOREN DER POLYPEPTIDKETTE AUF DEN
TRANSLOKATIONSPROZESS 80
3.4 MOEGLICHER EINFLUSS VON
TRANS-
FAKTOREN AUF DIE ER-TRANSLOKATION
INTRINSISCH UNSTRUKTURIERTER VERSUS STRUKTURIERTER PROTEINE 83
3.5 ER-SIGNALSEQUENZE KOENNEN EINE MITOCHONDRIALE ZIELSTEUERUNG
VERMITTELN 86
3.6 NUTZEN UND PATHOPHYSIOLOGISCHE KONSEQUENZEN VON DUALEM
TARGETING 90
4 ZUSAMMENFASSUNG 95
5 MATERIAL 97
5.1 BIOLOGISCHES MATERIAL 97
5.1.1 BAKTERIENSTAEMME 97
5.1.2 ZELLLINIEN 97
5.2 PLASMIDE UND OLIGONUKLEOTIDE 98
2
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.1 PLASMIDE 98
5.2.2 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 98
5.3 SMALL INTERFERING RNA (SIRNA) 102
5.4 ANTIKOERPER 102
5.5 STANDARDGROESSENMARKER FUER PROTEINE UND NUKEINSAEUREN. 102
5.6 BIOLOGISCHE REAGENZIEN 103
5.7 CHEMISCHE REAGENZIEN 103
5.8 LOESUNGEN UND PUFFER 106
5.8.1 ALLGEMEIN 106
5.8.2 PUFFER FUER DIE RADIOAKTIVE MARKIERUNG IN BAKTERIEN 110
5.8.3 PUFFER ZUR AUFREINIGUNG DER SOMATOSTATIN-PRODOMAENE 110
5.9 MEDIEN 111
5.9.1 ALLGEMEIN 111
6.9.2 MEDIEN UND STAMMLOESUNGEN FUER DIE RADIOAKTIVE MARKIERUNG IN
BAKTERIEN .....111
5.10 KITS 113
5.11 GERAETE 114
5.12 SONSTIGE MATERIALEN 116
6 METHODEN 119
6.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 119
6.1.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION 119
6.1.2 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN 121
6.1.3 RESTRIKTION UND LIGATION 122
6.1.4 HERSTELLUNG CHEMISCH KOMPETENTER BAKTERIEN 123
6.1.5 T RANSFORMATION 124
6.1.6 DNA-PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS BAKTERIEN 124
6.1.6.1 PRAEPARATION VON NEU KLONIERTER PLASMID-DNA IM KLEINEN MASSSTAB
(MINI-PRAEPARATION) 124
6.1.6.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA IM GROESSEREN MASSSTAB (MIDI-
PRAEPARATION) 125
6.1.7 NEU GENERIERTE KONSTRUKTE 126
6.2 ZELLKULTUR 127
6.2.1 ZELLKULTIVIERUNG 127
6.2.2 ZELLPASSAGIERUNG 127
6.2.3 AUSPLATTIEREN VON ZELLEN.... . 127
3
INHALTSVERZEICHNIS
6.2.4 TRANSFEKTION VON ZELLEN 128
6.2.5 ZELLERNTE 129
6.3 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 129
6.3.1 IN VITRO TRANSKRIPTION 129
6.3.2 IN VITRO TRANSLATION, TRANSLOKATION UND PK-PROTEKTION 130
6.3.3 IN VITRO TARGETING-ASSAY 131
6.3.4 REKOMBINANTE EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER PRODOMAENE VON
SOMATOSTATIN 132
6.3.5 CD-ANALYSE 133
6.3.6 COOMASSIE-FAERBUNG 134
6.3.7 WESTERN BLOT ANALYSE 134
6.3.7.1 HERSTELLUNG VON GESAMTZELL-LYSATEN 134
6.3.7.2 GEWINNUNG DES POSTNUKLEAEREN UEBERSTANDES 135
6.3.7.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 135
6.3.6.4 NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 135
(SDS-PAGE) NACH LAEMMLI 135
6.3.6.5 SCHAEGGER-GELE 136
6.3.6.6 PROTEINTRANSFER AUF NITROZELLULOSE (WESTERN BLOT) 136
6.3.6.7 PONCEAU-FAERBUNG 136
6.3.6.8 IMMUNDETEKTION 137
6.3.6.9 VISUALISIERUNG UND QUANTIFIZIERUNG 137
6.3.8 SPEZIELLE PROTEINANALYTIK 138
6.3.8.1 NACHWEIS DER SEKRETION 138
6.3.8.2 NACHWEIS DES PROTEASOMALEN ABBAUS VON PROTEINEN 138
6.3.8.3 DEGLYKOSYLIERUNG VON PROTEINEN 138
6.3.8.4 DIGITONIN-SOLUBILISIERUNGS-ASSAY 139
6.3.8.5 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON PROTEINEN MIT L-[35S]METHIONIN 139
6.3.8.5.1 SAEUGER-ZELLEN 139
6.3.8.5.2 BAKTERIEN 140
6.3.8.6 IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSE 142
6.3.8.7 SEC61A1 -KNOCKDOWN MITTELS RNA-INTERFERENZ 143
6.3.8.8 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 143
6.3.8.9 STATISTISCHE AUSWERTUNG 144
7 BIBLIOGRAPHIE 145
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 163
4
INHALTSVERZEICHNIS
9 VEROEFFENTLICHUNGEN 167
DANKSAGUNG 169
5
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