Identifizierung und Charakterisierung von Assemblierungs-Grenzflächen ligandengesteuerter Ionenkanäle:
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| Published: |
Aachen
Shaker
2013
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1 EINLEITUNG UND ZIELSETZUNG 1
1.1 EINLEITUNG 1
1.1.1 EINTEILUNG DER REZEPTOREN IN REZEPTORENFAMILIEN 1
1.1.2 LIGANDENGESTEUERTE IONENKANAELE 2
1.1.2.1 DER GLYCIN-REZEPTOR
(GLYR) 5
1.1.2.2 DER 5HT
3
-REZEPTOR PHT.R) 6
1.1.2.3
DER
GABA
V-RCZEPTOR
(GABA
A
R)
9
1.1.3 HOCHAUFLOESENDE STRUKTUREN 10
1.1.3.1 DER NICOTINISCHE ACETYLCHOLINREZEPTOR (NACHR) 12
1.1.3.2 DAS ACETYLCHOLINBINDEPROTEIN (ACHBP) 13
1.1.3.3 PENTAMERE LIGANDENGESTEUERTE LONENKANAELE IN PROKARYOTEN 14
1.1.3.4 KRISTALLSTRUKTUREN EINES EUKARYOTISCHEN IONENKANALS 17
1.1.4 REZEPTORASSEMBLIERUNG 19
1.2 ZIELSETZUNG 21
2 MATERIAL UND METHODEN 23
2.1 MATERIAL 23
2.1.1 CHEMIKALIEN 23
2.1.2 DETERGENZIEN 23
2.1.3 PCR-PRIMER 23
2.1.4 ENZYME 23
2.1.5 WASSER 23
2.1.6 VERWENDETE PUFFER UND KITS 24
2.1.6.1 PUFFER 24
2.1.6.2 KOMMERZIELLE KITS FUER DIE DNA-AUFREINIGUNG 27
2.2 METHODEN 28
2.2.1 MODIFIKATIONEN DER CDNA-KONSTRUKTE 28
2.2.1.1 BESCHREIBUNG DER ZUR
KLONIERUNG VERWENDETEN VEKTOREN 28
2.2.1.2 HERSTELLUNG UND BEHANDLUNG DER BENOETIGTEN PLASMIDE 28
2.2.1.3 MODIFIKATIONEN MIT HILFE GERICHTETE MUTAGENESE 29
2.2.1.4 GATEWAY KLONIERUNG 29
2.2.1.5 *ONE-TUBE-CLONING 30
2.2.1.6 MEGAPRIMER 31
2.2.1.7 DNA-SEQUENZIERUNG 32
2.2.1.8 KLONIERTE CDNA-KONSTRUKTE 32
HTTP://D-NB.INFO/1029616299
2.2.2 RNA-SYNTHESE 32
2.2.3 XENOPUS LAEVIS-OOCYTEN ALS EXPRESSIONSSYSTEM 33
2.2.3.1 XENOPUS
LAEVIS 33
2.2.3.2 HALTUNG DER FROESCHE 33
2.2.3.3 GEWINNUNG DES OVARS 33
2.2.3.4 KOLLAGENASE-BEHANDLUNG DER XENOPUS LAEVIS-OOCYTEN 34
2.2.3.5 CRNA-INJEKTION IN XENOPUS
LAEVIS-OOCYTEN 34
2.2.4 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 34
2.2.4.1 METABOLISCHE MARKIERUNG MITTELS L-[
35
S]-METHIONIN 34
2.2.4.2 MARKIERUNG DER OBERFLAECHENPROTEINE MITTELS CY5- BZW.
IR800-FARBSTOFF...35
2.2.4.3 AUFREINIGUNG DER PROTEINE MITTELS NI
2+
-CHELATCHROMATOGRAPHIE
BZW. STREP-TACTIN-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 35
2.2.5 AUFTRENNUNG DER PROTEINE MITTELS POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(PAGE) 37
2.2.5.1 BLAUE NATIVE-PAGE (BN-PAGE) 37
2.2.5.2 DENATURIERENDE SDS-PAGE 38
2.2.6 DETEKTION DER PROTEINE 40
2.2.6.1 TYPHOON-FLUORESZENZLMAGING UND ODYSSEY-FLUORESZENZLMAGING 40
2.2.6.2 PHOSPHORLMAGING 41
2.2.7 ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME AN XENOPUS LAEVIS-OOCYTEN 41
2.2.7.1 PRINZIPIELLER TEVC-AUFBAU 42
2.2.7.2 APPLIKATION VON REZEPTORAGONISTEN 42
2.2.13 TEVC-MESSPROTOKOLLE 43
2.2.7.4 DATENANALYSE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG 45
2.2.8 MOLECULAR MODELLING 45
3 ERGEBNISSE 46
3.1 ASSEMBLIERUNG DES 5HT
3A
RS 46
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG DER FUER DIE HOMOPENTAMERE ASSEMBLIERUNG WICHTIGEN
AMINOSAEUREN DER TMD4 DURCH ALANIN-SCANNING-MUTAGENESE 47
3.1.2 FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNGEN BESTAETIGEN DIE RELEVANZ DER TMD4 DES
5HT3
A
RS FUER
DIE ASSEMBLIERUNG ZU HOMOPENTAMEREN 51
3.1.3 DIE TMD1 UND TMD3 DER 5HT3
A
R-UNTEREINHEIT ENTHALTEN EBENFALLS
ASSEMBLIERUNGSRELEVANTE AMINOSAEURERESTE 53
3.1.4 DIE DARSTELLUNG DER TMDS DER 5HT
3A
R-UNTEREINHEIT MIT HILFE EINES
HELICAL-WHEEL-PLOTS ZEIGT INTERAKTIONEN ZWISCHEN DEN IDENTIFIZIERTEN
ASSEMBLIERUNGSRELEVANTEN AMINOSAEUREN
59
3.1.5 EIN HOMOLOGIEMODELL DES 5HT3
A
RS DEUTET AUF
INTERAGIERENDE
AMINOSAEUREN INNERHALB DER TMDS SOWIE AUF
EINE SALZBRUECKE IN DER
UNTEREINHEIT DES 5HT3
A
RS
HIN 61
3.2 DIE 5HT
3A
R-ECTODOMAENE 64
3.2.1 EXPRESSION DER 5HT3
A
R-ECTODOMAENE 64
3.2.1.1 AGGREGATION DER 5HT3
A
R-ECTODOMAENE 65
3.3 EXPRESSION DES ACHBPS 68
3.3.1 DAS ACHBP IST IN DER LAGE, ZU PENTAMEREN ZU ASSEMBLIEREN 68
3.4 ASSEMBLIERUNGSRELEVANTE MOTIVE INNERHALB DES HGLYRS UND SEINER
ECTODOMAENE SOWIE INNERHALB DES ACHBPS 69
3.4.1 SUBSTITUTION ASSEMBLIERUNGSRELEVANTER MOTIVE INNERHALB DES HGLYRS
UND SEINER ECTODOMAENE SOWIE INNERHALB DES ACHBPS 69
3.4.2 MONOMERISIERUNG DER MULTIMERE DER GLYR-ECTODOMAENE
DURCH
PUNKTMUTATIONEN SPEZIELLER AMINOSAEUREN 74
3.5 ASSEMBLIERUNG DES GLIC-REZEPTORS 78
3.5.1 EXPRESSION DES GLICS UND DES GLICS
CODOF
78
3.5.2 DARSTELLUNG DES GLICS UND DES GLICS
COD
OPT
MITTELS SDS- UND
BN-PAGE-ANALYSE 80
3.5.2.1 MARKIERUNG VON DEN AN DER ZELLOBERFLAECHE EXPRIMIERTEN PROTEINEN
MITTELS CY5-MONO-NHS-ESTER UND IR800 80
3.5.2.2 ANALYSE DES OLIGOMERISIERUNGSZUSTANDES DES GLICS 81
3.5.2.3 EINFLUSS UNTERSCHIEDLICHER DETERGENZIEN AUF
DIE DARSTELLUNG DES GLICS ....83
3.5.3 VERAENDERUNG DER GLIC-EXPRESSION DURCH EINBAU EINER
ZUSAETZLICHEN
N-GLYKOSYLIERUNGSSTELLE 84
3.5.4 ASSEMBLIERUNGSDOMAENEN DES GLICS 86
3.5.4.1 UNTERSUCHUNG DES ASSEMBLIERUNGSVERHALTENS DES GLICS DURCH EINE
ALANIN-BLOCKMUTATION 87
3.5.4.2 IDENTIFIZIERUNG VON ASSEMBLIERUNGSDOMAENEN DES GLICS 89
3.5.4.3 EINORDNUNG DER BIOCHEMISCHEN ERGEBNISSE IN DIE GESAMTSTRUKTUR
DES GLICS 100
3.5.5 ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN DES GLICS
UND DES GLICS
COD
OP,
103
3.6 DER GLUCL-REZEPTOR 104
3.6.1 EXPRESSION DES GLUCL-REZEPTORS UND SEINE DARSTELLUNG MIT HILFE
DER SDS- UND BN-PAGE-ANALYSE 104
4 DISKUSSION 106
4.1 ASSEMBLIERUNGDOMAENEN DES MURINEN 5HT
3A
RS 106
4.1.1 DIE ASSEMBLIERUNG VON HOMOPENTAMEREN 5HT3
A
RS WIRD NICHT ALLEINE
DURCH DIE N-TERMINALE DOMAENE VERMITTELT 107
4.1.2 INNERHALB DER TMDS DES 5HT
3A
RS SIND VOR ALLEM ALIPHATISCHE
AMINOSAEUREN VON BEDEUTUNG 108
4.1.3 DIE ASSEMBLIERUNGSRELEVANTEN AMINOSAEURERESTE IN DEN TMDS
DES 5HT
3A
RS KOENNTEN EINEN *LEUCIN-ZIPPER BZW. EIN
*KNOBS-INTO-HOLES-MOTIV DARSTELLEN
108
4.1.4 EINE SALZBRUECKE ZWISCHEN AMINOSAEUREN DER ZWEITEN UND VIERTEN TMD
DES
5HT
3A
RS
KOENNTE EIN WEITERES ASSEMBLIERUNGSMOTIV DARSTELLEN
111
4.2 ASSEMBLIERUNGSDOMAENEN DES HGLYRS UND DES ACHBPS 115
4.3 HETEROLOGE EXPRESSION DES PROKARYOTISCHEN CYS-LOOP-HOMOLOGS GLIC
IN EINEM EUKARYOTISCHEN SYSTEM 117
4.4 ASSEMBLIERUNGSDOMAENEN DES PROKARYOTISCHEN CYS-LOOP-HOMOLOGS GLIC 119
4.4.1 EINORDNUNG DER BIOCHEMISCHEN ERGEBNISSE DES GLICS IN DEN KONTEXT
DER BISHER UNTERSUCHTEN CYS-LOOP-REZEPTOREN 120
5 ZUSAMMENFASSUNG 123
6 LITERATURVERZEICHNIS 125
7 ANHANG 149
7.1 KLONIERTE CDNA-KONSTRUKTE 149
7.2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 164
8 VEROEFFENTLICHUNGEN 166
9 LEBENSLAUF 167
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