Analyse der NFATc1-Genexpression durch eGFP-BAC-Reportermäuse:
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 DIE FAMILIE DER
NFAT-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 1
1.1.1 DIE PROTEINSTRUKTUR DER
NFAT-TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 1
1.1.2 WICHTIGE SIGNALWEGE ZUR
REGULATION DER NFAT-FAKTOREN 3
1.1.3 DIE AKTIVIERUNG VON
SIGNALKASKADEN 6
1.1.4 DER FAKTOR NFATCL 7
1.2 DER IL-2-PROMOTER ALS BEISPIEL EINES
NFAT-TARGETS 9
1.3 NFAT-FAKTOREN UND
DIE IMMUNOLOGISCHE TOLERANZ 10
1.5 DAS NFATCL
-GEN 11
1.5.1 DIE REGULATION
VON NFATCL 11
1.5.2 DIE AUTOREGULATION VON
NFATCL/A A 12
1.6 PROTEIN- UND FLUORESZENZ-EIGENSCHAFTEN DES GRUEN-FLUORESZIERENDEN
PROTEINS (GFP) 13
1.7 DAS EGFP-BAC REPORTERKONSTRUKT 15
1.8 DAS FUNKTIONSPRINZIP
DES NFATCL-EGFP-BAC KONSTRUKTS 16
1.9 FRAGESTELLUNG 17
2. MATERIAL 18
2.1 ALLGEMEINE MATERIALIEN 18
2.2 CHEMIKALIEN 18
2.3 INSTRUMENTE 20
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2.4 ENZYME/KITS 21
2.5 ANTIKOERPER FUER FACS 21
2.6 ANTIKOERPER FUER WESTERN BLOT UND
IMMUNHISTOCHEMIE 22
2.7 OLIGONUKLEOTIDE 22
2.8 GENMARKER 23
2.9 PUFFER UND LOESUNGEN 23
2.10 ZELLKULTURMEDIEN 25
2.11 MAEUSE 25
3. METHODEN 26
3.1 AUFBEREITUNG DER MAUS-SCHWANZSPITZEN ZUR GENOTYPISIERUNG 26
3.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 26
3.3 DNA-GELELEKTROPHORESE 27
3.4 ZELLKULTIVIERUNG 28
3.4.1 ISOLATION VON LEUKOZYTEN 28
3.4.2 ISOLATION VON T - LYMPHOZYTEN 28
3.4.3 STIMULATION VON GESAMT-MILZ-ZELLEN 29
3.4.4 STIMULATION VON CD4* LYMPHOZYTEN 29
3.4.5 MIXED LYMPHOCYTE REACTION
(MLR) 29
3.4.6 RESTIMULATION VON
GESAMT-MILZ-ZELLEN 30
3.5 WESTERN BLOT 30
3.5.1 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN 30
3.5.2 MESSUNG DER PROTEINKONZENTRATION
NACH BRADFORD 31
3.5.3 STANDARDISIERUNG DER PROTEINKONZENTRATIONEN 31
3.5.4 SDS-PAGE 31
3.5.5 WESTERN BLOT
UND ANTIKOERPERFAERBUNG 32
3.6 SEMIQUANTITATIVE RT-PCR 33
3.6.1 RNA-EXTRAKTION 33
3.6.2 BESTIMMUNG DER RNA-KONZENTRATION UND BEURTEILUNG DER RNA
QUALITAET 33
3.6.3 SYNTHESE VON EINSTRAENGIGER
CDNA DURCH
RT-PCR 34
3.7 FLUORESCENCE ACTIVATED CELL
SORTING (FACS) 34
3.7.1 FACS-FAERBUNG VON ZELLMEMBRAN-ANTIGENEN 34
3.7.2 FACS-FAERBUNG VON INTRAZELLULAEREN ZYTOKINEN 35
3.7.3 FACS-FAERBUNG MIT ANNEXIN
V UND
PROPIDIUM LODID 35
3.7.4 PKH26 MEMBRANFAERBUNG 36
3.8 ZELLFAERBUNG FUER DIE
FLUORESZENZMIKROSKOPIE 36
4. ERGEBNISSE 38
4.1 DIE GFP-EXPRESSION DER REPORTERMAUSLINIEN
B6 NFATCIGFP BAC1-6.. 38
4.2 CHARAKTERISIERUNG DER GFP POPULATION 39
4.2.1 DIE GFP-NEGATIVE POPULATION BESTEHT AUS APOPTOTISCHEN UND
NEKTROTISCHEN ZELLEN 39
4.2.2 DIE GFP-EXPRESSION ZEIGT KEINE UNTERSCHIEDE ZWISCHEN
PROLIFERIERENDEN UND NICHT PROLIFERIERENDEN
ZELLEN 41
4.3 FACS-ANALYSE DER GFP-FLUORESZENZ IN T- UND B- ZELLEN VERSCHIEDENER
MAUSLINIEN 43
4.4 DIE GFP-EXPRESSION DER NFATC1-EGFP-REPORTERMAEUSE IST INDUZIERBAR
UND CSA-SENSITIV 44
4.5. KORRELATION ZWISCHEN DER EXPRESSION VON NFATCL UND GFP IN
GESAMTMILZZELLEN UND T-LYMPHOZYTEN 46
4.5.1 KORRELATION DER MRNA-SYNTHESE VON NFATCL UND GFP IN
MILZZELLKULTUR 46
4.5.2 KORRELATION DER MRNA-SYNTHESE VON NFATCL UND GFP IN T-
ZELLKULTUREN 47
4.5.3 KORRELATION DER PROTEINSYNTHESE VON NFATCL UND GFP IN
MILZZELLKULTUREN 49
4.5.4 KORRELATION VON NFATCL- UND EGFP-EXPRESSION AUF EINZEL-
ZELLEBENE 50
4.6 DIE KORRELATION DER GFP-EXPRESSION MIT LYMPHOZYTENAKTIVIERUNG UND
ZYTOKINPRODUKTION 52
4.6.1 DIE GFP-EXPRESSION KORRELIERT BEI PRIMAERSTIMULATION VON MILZZELLEN
MIT DER EXPRESSION VON AKTIVIERUNGSMARKERN UND DER
ZYTOKINPRODUKTION 52
4.6.2 MILZZELLEN ZEIGEN BEI RESTIMULATION EINEN HOHEN ANTEIL AN IL-2
PRODUZENTEN, ABER KEINE ZUNAHME
DER GFP-FLUORESZENZ 54
4.6.3 DIE GFP-EXPRESSION
IM KULTURVERLAUF 55
4.7 DIE ANALYSE DER GFP-EXPRESSION IN SUBPOPULATIONEN VON T-
LYMPHOZYTEN 56
4.7.1 CD4*CD25* NTREGS ZEIGEN EINE STARK ABGESCHWAECHTE GFP-
INDUKTION BEI STIMULATION MIT ACD3/CD28 56
4.7.2 CD4*CD25* ITREGS ZEIGEN EINE STARK ABGESCHWAECHTE
GFP-INDUEKTION
BEI STIMULATION MIT A CD3/CD28 58
4.7.3 ALLOREAKTIVE CD25* UND CD69* T-ZELLEN ZEIGEN EINE ERHOEHTE GFP
EXPRESSION IN VITRO 59
4.7.4 TGF-0 INHIBIERT DIE ZUNAHME DER GFP-EXPRESSION IN AKTIVIERTEN T-
ZELLEN 60
4.8 DIE GFP-EXPRESSION IN THYMOZYTEN 62
4.8.1 THYMOZYTEN ZEIGEN DIE
SCHWAECHSTE MITTLERE GFP-FLUORESZENZ....
62
4.8.2 FACS-ANALYSE DER GFP-EXPRESSION IN CD47CD8* - POPULATIONEN
AUS THYMUS UND
PERIPHEREM BLUT 63
5. DISKUSSION 65
5.1 BEI PRIMAERSTIMULATION REFLEKTIERT DIE GFP-EXPRESSION DIE INDUKTION
VON
NFATCL 65
5.2 FEHLENDE INDUKTION VON GFP
BEI RESTIMULATION 68
5.3 NFATCL UND APOPTOSE 69
5.4 NFATCL IST HOCH EXPRIMIERT IN CD4 CD8 DN THYMOZYTEN 70
5.5 VERMINDERTE EXPRESSION VON GFP IN NATUERLICH VORKOMMENDEN UND
INDUZIERBAREN REGULATORISCHEN T-LYMPHOZYTEN 71
5.6 TGF-
SS
INHIBIERT DIE ZUNAHME DER EGFP-FLUORESZENZ
IN T-ZELLEN 72
5.7 PERSPEKTIVEN 73
6. ZUSAMMENFASSUNG 74
7. LITERATURVERZEICHNIS 76
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