Charakterisierung des NMDA-Rezeptors unter Masernvirusinfektion:
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2012
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VERZEICHNISSE
I N H A L T S V E R Z E I C H N I S
I
V
VII VIII
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
TABELLENVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. DIE MASERN 1
1.2. DAS MASERNVIRUS 3
1.2.1. AUFBAU D E S MV U N D FUNKTION D E R VIRALEN PROTEINE 3
1.2.2. AUFBAU D E S MV-GENOMS U N D FUNKTION D E R MV-GENE 4
1.2.3. MV-REZEPTOREN 6
1.3. MV-ASSOZIIERTE ZNS-KOMPLIKATIONEN 7
1.4. DAS MV UND D E R NMDA-REZEPTOR 9
1.4.1. NMDA-REZEPTOREN 10
1.4.2. WIRKUNGSWEISE U N D MODULATION D E S NMDA-REZEPTORS 12
1.4.3. EXZITOTOXIZITAET 1 3
1.5. CHINOLINSAEURE U N T E R Z E R E B R A L E R MV-INFEKTION 1 5
1.6. HERSTELLUNG E I N E S R E K O M B I N A N T E N MV 18
1.7. PROBLEMSTELLUNG U N D ZIELSETZUNG 2 1
MATERIAL 2 2
2.1. ZELLLINIEN 2 2
2 . 2 . ANTIKOERPER 2 2
2.3. BAKTERIEN 2 3
2 . 4 . VIREN 2 3
2 . 5 . ENZYME 2 3
2 . 6 . R E A G E N Z S Y S T E M E 2 3
2.7. OLIGONUKLEOTIDE 2 4
2.8. PLASMIDE 2 6
2.9. S T A N D A R D S 2 6
2.10. ARBEITSMATERIALIEN 2 7
2.11. REAGENZIEN 2 8
2.12. ZELLKULTURMEDIEN UND Z U S AE T Z E 3 0
2.13. G E R AE T E 3 0
I
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IMAGE 2
2.14. Z U S A M M E N S E T Z U N G D E R MEDIEN U N D PUFFER
2.15. Z U S A M M E N S E T Z U N G D E R ELEKTROPHYSIOLOGISCHEN
LOESUNGEN
3. METHODEN
3.1. ELEKTROPHYSIOLOGISCHE METHODEN
3.1.1. PATCH-CLAMP TECHNIK
3.1.2. CALCIUM-IMAGING
3.2. GRAPHISCHE U N D STATISTISCHE AUSWERTUNG
3.3. TIERMODELL
3.4. ZELLKULTIVIERUNG
3.4.1. ANLAGE D E R PRIMAEREN NEURONENKULTUR
3.4.2. KULTIVIERUNG V O N A D H AE R E N T E N ZELLEN
3.4.3. MYKOPLASMENTEST
3.4.4. EINFRIEREN/AUFTAUEN V O N ZELLEN
3.4.5. TRANSFEKTION
3.5. VIROLOGISCHE METHODEN
3.5.1. ERSTELLUNG E I N E S MV-STOCKS
3.5.2. PLAQUE-ASSAY
3.5.3. PLAQUE-REINIGUNG
3.5.4. ENDPUNKTTITRATION (TCID 50 )
3.5.5. INFEKTION VON ZELLEN
3.5.6. MV-INFEKTION V O N R A T T E N
3.5.7. MV-RESCUE
3.6. IMMUNFLUORESZENZ
3.6.1. I M M U N Z Y T O C H E M I S C H E FAERBUNG A N FIXIERTEN ZELLEN
3.6.2. I M M U N Z Y T O C H E M I S C H E FAERBUNG A N L E B E N D E N
ZELLEN
3.7. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
3.7.1. RNA-ISOLATION
3.7.2. REVERSE TRANSKRIPTION
3.7.3. PCR-AMPLIFIKATION
3.7.3.1. STANDARD-PCR
3.7.3.2. PCR-AMPLIFIKATION MIT F R A G M E N T E N 1 K B
3.7.3.3. KOLONIE-PCR
3.7.3.4. LINEARE PCR
3.7.3.5. FUSIONS-PCR
3.7.4. GELELEKTROPHORESE
3.7.5. DNA-AUFREINIGUNG
VERZEICHNISSE
3 2
3 4
3 5
3 5
3 5
3 8
4 0
4 1
4 1
4 1
4 2
4 3
4 4
4 5
4 6
4 6
4 6
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4 9
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5 1
5 2
5 2
5 2
5 3
5 3
5 4
5 4
5 5
5 5
5 6
5 7
5 7
I I
IMAGE 3
VERZEICHNISSE
3.7.6. KLONIERUNG PCR-AMPLIFIZIERTER DNA 5 7
3.7.6.1. TA-KLONIERUNG 5 7
3.7.6.2. GERICHTETE KLONIERUNG 5 8
3.7.6.3. TRANSFORMATION V O N CHEMISCH K O M P E T E N T E N BAKTERIEN 5
8
3.7.7. PLASMID-ISOLIERUNG A U S BAKTERIEN 5 9
3.7.8. KONZENTRATIONSMESSUNG V O N NUKLEINSAEUREN 5 9
3.7.9. RESTRIKTIONSVERDAU 5 9
3.7.10. SEQUENZIERUNG 6 0
3.7.11. REAL-TIME PCR 6 1
4. ERGEBNISSE 6 3
4.1. ANALYSE D E S NMDA-REZEPTORS 6 3
4.1.1. OPTIMIERUNG D E R PRIMAEREN NEURONENKULTUR 6 3
4.1.2. ERMITTLUNG D E R OPTIMALEN NMDA-KONZENTRATION 6 5
4.1.3. KINETIK D E R NMDA-REZEPTORAKTIVITAET 6 6
4.1.4. MRNA-EXPRESSION D E R NRL-UNTEREINHEIT D E S NMDA-REZEPTORS 6 8
4.2. NMDA-REZEPTORAKTIVITAET U N T E R MV-INFEKTION 6 9
4.2.1. ANALYSE D E R INFEKTION 6 9
4.2.2. PATCH-CLAMP ANALYSE E I N E R MV-INFIZIERTEN PRIMAEREN
NEURONENKULTUR 7 2
4.2.3. NMDA-REZEPTORAKTIVITAET MOCK-INFIZIERTER U N D MV-INFIZIERTER
PRIMAERER 7 3
NEURONENKULTUREN
4.2.3.1. PATCH-CLAMP ANALYSE 7 3
4.2.3.2. CALCIUM-IMAGING ANALYSE 7 5
4.2.3.3. ETABLIERUNG E I N E R IMMUNZYTOCHEMISCHEN FAERBUNG UNFIXIERTER 7
7
NEURONE Z U R IDENTIFIKATION E I N E R MV-INFEKTION
4.2.3.4. VERGLEICH D E R NMDA-REZEPTORAKTIVTAET MOCK-INFIZIERTER U N D
MITTELS 7 9
IMMUNFLUORESZENZ IDENTIFIZIERTER MV-INFIZIERTER N E U R O N E
4.3. EINFLUSS V O N QUIN A U F DIE AKTIVITAET D E S NMDA-REZEPTORS 8 1
4.3.1. NMDA-REZEPTORAKTIVITAET BEI PHYSIOLOGISCHER QUIN-KONZENTRATION 8 1
4.3.2. NMDA-REZEPTORAKTIVITAET BEI PATHOLOGISCH E R H OE H T E R
QUIN-KONZENTRATION 8 3
4.3.3. NMDA-REZEPTORAKTIVITAET BEI S T A R K E R H OE H T E R
QUIN-KONZENTRATION 8 6
4.3.4. CALCIUM-IMAGING ANALYSE 8 8
4.3.4.1. NMDA-INDUZIERTE ERHOEHUNG D E R INTRAZELLULAEREN 8 8
KALZIUMKONZENTRATION
4.3.4.2. ANALYSE D E R BASALEN INTRAZELLULAEREN KALZIUMKONZENTRATION 8 9
4.3.5. EXPRESSION D E R NRL-MRNA BEI V E R S C H I E D E N E N
QUIN-KONZENTRATIONEN 9 0
4.4. DARSTELLUNG E I N E S REKOMBINANTEN MV 9 2
4.4.1. KONSTRUKTION D E R PLASMIDVEKTOREN FUER DIE MV-RESCUE 9 2
I I I
IMAGE 4
VERZEICHNISSE
4.4.2. KONTROLLE D E R KOMPONENTEN D E S MV-RESCUE 9 9
4.4.2.1. ANALYSE D E S MV-VOLLLAENGEPLASMIDS 9 9
4.4.2.2. ANALYSE D E R HELFERPLASMIDE 102
4.4.3. GEWINNUNG D E S R E K O M B I N A N T E N MV 105
5 . DISKUSSION 1 0 6
5.1. MV-ASSOZIIERTE ENZEPHALITIDEN & D E R NMDA-REZEPTOR 106
5.2. EINFLUSS VON QUIN A U F D E N NMDA-REZEPTOR 1 1 3
5.3. AUSBLICK FUER T H E R A P E U T I S C H E ANSAETZE 1 2 1
5.4. KONSTRUKTION E I N E S N E U R O T R O P E N , REKOMBINANTEN MV 1 2
3
6 . ZUSAMMENFASSUNG 1 2 6
ABSTRACT 1 2 8
7 . LITERATUR 1 3 0
EIGENE ARBEITEN I
ERKLAERUNG III
DANKSAGUNG I V
LEBENSLAUF V
IV
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