Metabolic Engineering von Corynebacterium glutamicum für die Produktion einer Dicarbonsäure:
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Jülich
Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek, Verl.
2013
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
I SUMMARY 1
II ZUSAMMENFASSUNG 2
III EINLEITUNG 4
1 PETROCHEMIE UND DIE ZUKUNFT VON BIORAFFINERIEN 4
2 ITACONSAEURE 5
2.1 CHEMISCHE SYNTHESE 7
2.2 BIOTECHNOLOGISCHE HERSTELLUNG 8
2.3 BIOSYNTHESEWEG 9
3 C/S-ACONITAT-DECARBOXYLASE (CAD) 11
4 CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ALS ITACONAT-PRODUZENT 12
5 ZIELE DER ARBEIT 13
IV MATERIAL UND METHODEN 14
1 PUFFER UND STAMMLOESUNGEN 14
2 NAEHRMEDIEN 14
3 OLIGONUKLEOTIDE 15
4 PLASMIDE 18
5 ORGANISMEN 20
6 STAMMHALTUNG VON BAKTERIEN 2 1
7 KULTIVIERUNG VON BAKTERIENSTAEMMEN 22
7.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI 22
7.2 EXPRESSIONSKULTUREN 22
7.3 KULTIVIERUNG VON C. GLUTAMICUM 22
8 BESTIMMUNG VON WACHSTUMS- UND STOFFWECHSELPARAMETERN 23
8.1 BESTIMMUNG DES WACHSTUMS VON BAKTERIEN-KULTUREN 23
8.2 BESTIMMUNG DES PH-WERTES 23
8.3 BESTIMMUNG ORGANISCHER SAEUREN UND VON GLUCOSE IM
KULTIVIERUNGSUEBERSTAND
MITTELS HPLC 24
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
8.4 QUALITATIVE UND QUANTITATIVE ITACONAT-BESTIMMUNG 24
8.5 BESTIMMUNG INTRAZELLULAERER METABOLITE MITTELS HPLC 25
8.6 BESTIMMUNG ORGANISCHER SAEUREN MITTELS GC-TOF-MS 26
9 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 27
9.1 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER C. GLUTAMICUM-
ZELLEN 27
9.2 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI- ZELLEN 27
9.3 INTEGRATION VON GENEN UND EINFUEHRUNG CHROMOSOMALER MUTATIONEN MIT
HILFE DES
PK19MOBSACSS-SYSTEMS 28
10 DNA-TECHNIKEN 30
10.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 30
10.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS C. GLUTAMICUM 30
10.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 30
10.4 PCR-PURIFICATION-KIT 30
10.5 BESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREKONZENTRATIONEN 3 1
10.6 DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 3 1
10.7 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 3 1
10.8 KOLONIE-PCR 32
10.9 DNA-SEQUENZANALYSE 32
10.10 RESTRIKTIONSVERDAU 33
10.11 LIGATION 33
10.12 SITE-DIRECTED MUTAGENESE 33
10.13 KONSTRUKTION VON PLASMIDEN 33
11 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 35
11.1 ZELLAUFSCHLUSS MITTELS FRENCH-PRESS-ZELLE 35
11.2 ZELLAUFSCHLUSS MITTELS SILAMAT 36
11.3 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 36
11.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 36
11.5 NI-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 37
11.6 PUFFERAUSTAUSCH DURCH GELFILTRATION M I T HILFE VON PD-10-SAEULEN 37
11.7 ENZYMASSAYS 38
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
V ERGEBNISSE 40
1 ANALYSE DER ITACONAT-TOLERANZ VON C. GLUTAMICUM UND FAEHIGKEIT ZUR
ITACONATVERSTOFFWECHSELUNG 40
2 KONSTRUKTION UND ANALYSE EINES ITACONAT-PRODUKTIONSSTAMMES (1.
GENERATION) 42
2.1 ANALYSE DER ITACONAT-PRODUKTION VON C. GLUTAMICUM/PEKEX2-CAD OPT U N
D
C. G/UTAM/'CUM/PEKEX2-MSMEG_6856 43
2.2 HETEROLOGE UEBERPRODUKTION, REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
N-HISI 0MSMEG_6856 AUS MYCOBACTERIUM SMEGMATIS IN E. COLI BL21(DE3) 46
3 VERSUCHE ZUR ERHOEHUNG DER INTRAZELLULAEREN C/S-ACONITAT-KONZENTRATION
MIT HILFE VON
2-METHYLCITRAT-DEHYDRATASEN 48
3.1 HETEROLOGE UEBERPRODUKTION UND REINIGUNG VON PRPDL-, PRPD2- UND
2-MCD2DERIVATEN 48
3.2 KULTIVIERUNG VON C. GLUTAMICUM/PEKEX2-CAD OPT-PRPD2 5 1
3.3 AUSTAUSCH DER CORYNEBACTERIELLEN ACONITASE GEGEN HETEROLOGE
ACONITASEN 52
4 STEIGERUNG DER CAD-AKTIVITAET MIT HILFE EINES CAD-MALE-FUSIONSPROTEINS
53
5 VARIATION DER KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN F UE R DIE ITACONAT-PRODUKTION
56
5.1 KOHLENSTOFFPULSEXPERIMENTE 57
5.2 STICKSTOFFLIMITIERUNG 57
6 REDUZIERUNG DER ICD-AKTIVITAET ZUR VERBESSERUNG DER
C/'S-ACONITAT-VERFUEGBARKEIT 60
6.1 ANALYSE DER STAEMME MIT REDUZIERTER ICD-AKTIVITAET 6 1
7 EINFLUSS PUTATIVER ITACONAT-TRANSPORTER AUS A. TERREUS AUF DIE
ITACONAT-PRODUKTION MIT
C. GLUTAMICUM 64
8 VERSUCHE ZUR ITACONAT-PRODUKTION BEI KULTIVIERUNG IN BIOREAKTOREN 65
VI DISKUSSION 70
1 C. GLUTAMICUM ALS WIRTSORGANISMUS FUER DIE ITACONAT-PRODUKTION 7 1
2 KONSTRUKTION UND ANALYSE DER PRODUKTIONSSTAEMME DER 2. UND 3.
GENERATION 78
3 SCHLUSSFOLGERUNG UND PERSPEKTIVE 8 1
VII LITERATURVERZEICHNIS 84
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
VIII ANHANG 93
1 GENSEQUENZ DES FUER C. GLUTAMICUM CODON-USAGE OPTIMIERTEN COD-GENS 93
2 SUCHE NACH HOMOLOGEN DER C/S-ACONITAT-DECARBOXYLASE (CAD) 93
3 ANALYSE DER CODON-USAGE DES COD-GENS 95 |
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