Untersuchung neuartiger Substanzen auf antineoplastische und antiangiogene Eigenschaften beim testikulären Keimzelltumor:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1. TESTIKULAERER KEIMZELLTUMOR 1
1.1.1. DEFINITION UND EINTEILUNG 1
1.1.2. URSACHEN UND GENESE 5
1.1.3. INZIDENZ UND THERAPIE 6
1.2. ANGIOGENESE UND IHRE BEDEUTUNG
BEIM TUMORWACHSTUM 9
1.2.1. MECHANISMEN DER BLUTGEFAESSBILDUNG 9
1.2.1.1. VASKULOGENESE 10
1.2.1.2. ANGIOGENESE 10
1.2.1.3. INTUSSUSZEPTION 11
1.2.2. TUMORANGIOGENESE 12
1.2.3. DAS VEGF-REZEPTORSYSTEM 14
1.3. ANGIOGENESEINHIBITION IN DER UROONKOLOGIE 16
1.3.1. THERAPEUTISCHE BEEINFLUSSUNG DER ANGIOGENESE 16
1.3.2. IN SILICO SCREENING 19
1.3.2.1. ABLAUF DES IN SILICO SCREENINGS MIT VATALANIB ALS LEITSTRUKTUR
20
1.4. ZIELSTELLUNG 23
2. MATERIAL & METHODEN 24
2.1. MATERIAL 24
2.1.1. ZELLLINIEN 24
2.1.2. MEDIEN, LOESUNGEN UND CHEMIKALIEN 24
2.1.3. EIER 26
2.1.4. ANTIKOERPER 26
2.1.5. PRIMER FUER DIE POLYMERASE-KETTENREAKTION 27
2.1.6. KOMMERZIELLE KITS 27
2.2. METHODEN 28
2.2.1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 28
2.2.1.1.
KRYOKONSERVIERUNG 28
2.2.1.2.
BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 28
2.2.1.3.
ZELLQUANTIFIZIERUNG MITTELS KRISTALLVIOLETT-METHODE 29
2.2.1.4.
ZYTOTOXIZITAETSNACHWEIS DURCH LDH-AKTIVITAETSMESSUNG 30
2.2.1.5.
ZELLZYKLUSANALYSE MITTELS DURCHFLUSSZYTOMETRIE (FACS) 31
2.2.1.6.
APOPTOSENACHWEIS MITTELS FLUOROMETRISCHER BESTIMMUNG DER 32
CASPASE-3-AKTIVITAET 32
2.2.1.7.
TUBE FORMATION ASSAY 32
I
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.8.
MIGRATIONSASSAY 34
2.2.2. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 35
2.2.2.1.
PRAEPARATION VON GESAMT-RNA 35
2.2.2.2.
REVERSE TRANSKRIPTASE POLYMERASE KETTENREAKTION (RT-PCR) 36
2.2.2.3.
GELELEKTROPHORESE ZUR AUFTRENNUNG VON DNA 38
2.2.2.4.
CDNA MIKROARRAY 38
2.2.3. PROTEINCHEMISCHE METHODEN 40
2.2.3.1.
HERSTELLUNG VON PROTEINLYSATEN 40
2.2.3.2.
BESTIMMUNG DES PROTEINGEHALTES 40
2.2.3.3.
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 41
2.2.3.4.
WESTERN BLOT 42
2.2.3.5.
IMMUNODETEKTION 42
2.2.4. CHORIOALLANTOISMEMBRAN (CAM) MODELL 43
2.2.4.1.
ANGIOGENESE-HEMMTEST 44
2.2.4.2.
UNTERSUCHUNGEN ZUM TUMORWACHSTUM 45
2.2.4.3.
IMMUNHISTOCHEMIE 46
2.2.5. STATISTIK 47
3. ERGEBNISSE 48
3.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG
VON HP-2 UND HP-14 48
3.1.1. MRNA-EXPRESSION DES VEGFR-2 IN ENDOTHEL- UND TUMORZELLEN 48
3.1.2. ANTIPROLIFERATIVE WIRKUNG VON HP-2 UND HP-14 49
3.1.3. BESTIMMUNG DER UNSPEZIFISCHEN ZYTOTOXIZITAET VON HP-2 UND HP-14 53
3.1.4. EINFLUSS VON HP-2 UND HP-14 AUF DIE ZELLZYKLUSREGULATION UND 53
APOPTOSE 53
3.1.5. EINFLUSS VON HP-2 UND HP-14 AUF DIE SIGNALTRANSDUKTION 57
3.1.6. KOMBINATIONSTHERAPEUTISCHE ANSAETZE VON HP-2 UND HP-14 MIT 59
CISPLATIN 59
3.1.7. GENEXPRESSIONSANALYSE IN CISPLATINSENSITIVEN UND
CISPLATINRESISTENTEN TKZT ZELLEN 61
3.2. ANTIANGIOGENE WIRKUNG NEUARTIGER
SUBSTANZEN 64
3.2.1. TUBE FORMATION 64
3.2.2. EINFLUSS AUF DIE MIGRATION VON ENDOTHELZELLEN 66
3.2.3. IN VIVO-EVALUIERUNG AM CHORIOALLANTOISMEMBRANMODELL (CAM) 67
3.3.
UNTERDRUECKUNG DES TUMORWACHSTUMS UND DER ANGIOGENESE
IN VIVO
69
3.3.1. UNTERSUCHUNGEN ZUM TUMORWACHSTUM IM CHORIOALLANTOIS-MEMBRANMODELL
69
3.3.2. UNTERDRUECKUNG DER TUMORVERSORGENDEN GEFAESSNEUBILDUNG
(TUMORANGIOGENESE) 71
4. DISKUSSION 74
4.1. ZIELGERICHTETE THERAPIE DES TESTIKULAEREN KEIMZELLTUMORS 74
4.1.1. WACHSTUMSSTUDIEN 76
II
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.2. KOMBINATION VON HP-2 UND HP-14 MIT CISPLATIN 78
4.1.3. VERAENDERUNG DER GENEXPRESSION NACH KOMBINATIONSBEHANDLUNG 79
4.1.4. MOLEKULARE GRUNDLAGEN DER WACHSTUMSINHIBITORISCHEN EFFEKTE 80
4.1.5. EINFLUSS AUF DIE REGULATION DES ZELLZYKLUS UND PROLIFERATIVER
SIGNALWEGE 81
4.1.6. IN VIVO UNTERSUCHUNGEN DER ANTIANGIOGENEN EIGENSCHAFTEN 83
4.2.
ABSCHLIESSENDE
BETRACHTUNG 85
5. ZUSAMMENFASSUNG 86
6. SUMMARY 88
7. LITERATURVERZEICHNIS 90
8. PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 108
8.1. ORIGINALARBEITEN 108
8.2. KURZVEROEFFENTLICHUNGEN 109
8.3. AUSZEICHNUNGEN UND PREISE 109
9. DANKSAGUNG 110
10. ANHANG 111
III
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