Spezifische Antigenbeladung kreuzpräsentierender dendritischer Zellen über den Chemokinrezeptor XCR1:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS 1
ABBILDUNGSVERZEICHNIS IV
TABELLENVERZEICHNIS V
1 EINLEITUNG 1
1.1 DENDRITISCHE ZELLEN 1
1.2 CHEMOKINE UND CHEMOKINREZEPTOREN 8
1.3 IMPFSTOFFE 9
1.4 ZIELE 12
2 MATERIAL UND METHODEN 13
2.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN UND MATERIALEN 13
2.2 PROBENMATERIAL 13
2.2.1 MAEUSE 13
2.2.2 MENSCHLICHE PROBEN 14
2.3 TIEREXPERIMENTELLE METHODEN 14
2.3.1 ADOPTIVER TRANSFER 14
2.3.2 IMMUNISIERUNG 15
2.3.3 SERUMPRAEPARATION 15
2.3.4 PROLIFERATIONSANALYSE 15
2.3.5 ZELLAUFNAHMEASSAY 15
2.3.6 FLT3-LIGAND-BEHANDLUNG 15
2.3.7 TUMORINDUKTION 16
2.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 16
2.4.1 VERWENDETE REAGENZIEN UND ZELLLINIEN 16
2.4.2 ZELLKULTURBEDINGUNGEN 17
2.4.3 ZELLZAHLBESTIMMUNG 17
2.4.4 TRYPSINIERUNG ADHAERENTER ZELLLINIEN 17
2.4.5 PRAEPARATION PRIMAERER ZELLEN 17
2.4.5.1 ISOLIERUNG VON ZELLEN AUS LYMPHATISCHEN ORGANEN 17
2.4.5.2 PRAEPARATION VON LUNGEN 18
2.4.5.3 ISOLIERUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN DES PERIPHEREN BLUTES (PBMC)
18
2.4.6 ANREICHERUNG VON MURINEN DENDRITISCHEN ZELLEN 18
2.4.7 MAGNETISCHE ZELLSORTIERUNG MURINER DENDRITISCHE ZELLEN 19
2.4.8 SORTIERUNG HUMANER DENDRITISCHER ZELLEN 19
2.4.9 HITZESCHOCKBEHANDLUNG VON MILZZELLEN UND BINDUNG VON XCL1 20
2.4.10 CHEMOTAXIS IM TRANSWELL-SYSTEM 21
2.5 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 21
2.5.1 FLUOROPHORE 21
2.5.2 MONOKLONALE ANTIKOERPER 22
2.5.3 FAERBUNG VON OBERFLAECHENANTIGENEN 24
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.5.4 INTRAZELLULAERE FAERBUNG VON MOLEKUELEN 24
2.5.5 FDG-FAERBUNG 25
2.5.6 APOPTOSEFARBUNG 25
2.5.7 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE MESSUNG UND SORTIERUNG 26
2.6 HISTOLOGIE 26
2.6.1 PRAEPARATION VON MILZEN UND ANFERTIGUNG VON KRYOSTATSCHNITTEN 26
2.6.2 IMMUNFLUORESZENZ 27
2.7 GENERIERUNG EINES MONOKLONALEN XCR1-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS 27
2.7.1 IMMUNISIERUNG 27
2.7.2 FUSION 28
2.7.3 SCREENING DER HYBRIDOME 29
2.7.4 SUBKLONIERUNG DER HYBRIDOME 29
2.7.5 REINIGUNG DES MONOKLONALEN ANTIKOERPERS 29
2.8 KOPPLUNG EINES MONOKLONALEN ANTIKOERPERS AN OVALBUMIN 30
2.9 BLOCKADEUNTERSUCHUNG DES XCR1-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERS 31
2.10 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) 31
2.10.1 ISOTYPBESTIMMUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 31
2.10.2 DETEKTION OVA-SPEZIFISCHER ANTIKOERPER 31
2.11 STATISTISCHE ANALYSEN 32
3 ERGEBNISSE 33
3.1 GENERIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG EINES XCR1-SPEZIFISCHEN
MONOKLONALEN ANTIKOERPERS.... 33
3.1.1 GENERIERUNG EINES HYBRIDOMS, DAS EINEN XCR1-SPEZIFISCHEN
ANTIKOERPER (MARX10) SEZERNIERT33
3.1.2 MARX 10 ERKENNT SPEZIFISCH EINEN TEIL DER CD8 + UND CD8
DENDRITISCHEN ZELLEN IN DER MILZ,
ABER KEINE ANDEREN ZELLPOPULATIONEN 35
3.1.3 MARX10 FAERBT IN DER HISTOLOGIE CD8 + CDLLC + ZELLEN IN T-ZELLZONE,
MARGINALZONE UND ROTER
PULPA 38
3.1.4 MARX 10 BLOCKIERT NICHT DIE BINDUNG VON XCL1 AN XCR1 40
3.1.4.1 MARX 10 BLOCKIERT NICHT DIE FAERBUNG VON XCR1 IN DER
DURCHFLUSSZYTOMETRIE 41
3.1.4.2 MARX 10 BLOCKIERT NICHT DIE MIGRATION CD8 + DZ ZU XCL1 42
3.2 XCR1-EXPRESSION IN LUNGE UND MEDIASTINALEM LYMPHKNOTEN 43
3.2.1 XCR1-EXPRESSION IN DER LUNGE KORRELIERT MIT CD103 UND CD207, ABER
NICHT MIT CD1 LB UND
CX3CR1, UND IST ABHAENGIG VOM TRANSKRIPTIONSFAKTOR BATF3 43
3.2.2 XCR1-EXPRESSION IM MEDIASTINALEN LYMPHKNOTEN KORRELIERT TEILWEISE
MIT CD103 UND CD8 UND
IST ABHAENGIG VOM TRANSKRIPTIONSFAKTOR BATF3 45
3.3 DIE WECHSELWIRKUNG VON XCR1 MIT SEINEM LIGANDEN XCL1 VERSTAERKT DIE
CD8 + T-ZELLANTWORT
47
3.3.1 ZUGABE VON XCL1 BEI EINER IMMUNISIERUNG MIT OVALBUMIN FUEHRT ZU
EINER VERSTAERKTEN TZELLPROLIFERATION 47
3.3.2 BINDUNG VON XCL1 AN ZELLEN VERSTAERKT DIE CD8 + T-ZELLAKTIVIERUNG
48
3.3.2.1 XCL1 BINDET AN NEKROTISCHE SPLENOZYTEN 48
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.2.2 NEKROTISCHE ZELLEN, AN DIE XCLI GEBUNDEN IST, WERDEN VERSTAERKT
VON XCR1 + DZ
AUFGENOMMEN . 50
3.3.2.3 NEKROTISCHE ZELLEN, AN DIE XCLI GEBUNDEN IST, INDUZIEREN EINE
VERSTAERKTE
CD8 + T-ZELLPROLIFERATION 52
3.4 SPEZIFISCHE ANTIGENBELADUNG KREUZPRAESENTIERENDER ZELLEN UEBER XCR1 53
3.4.1 XCL1-OVA UND MARX-OVA AKTIVIEREN OHNE ADJUVANS DENDRITISCHE ZELLEN
IN VIVO NICHT 53
3.4.2 IMMUNISIERUNGEN MIT XCL1-OVA UND MARX-OVA AKTIVIEREN
ANTIGENSPEZIFISCHE
CD8 + T-ZELLEN 54
3.4.3 IMMUNISIERUNGEN MIT XCL1-OVA UND MARX-OVA FUHREN ZUR BILDUNG
ANTIGENSPEZIFISCHER
ANTIKOERPER 58
3.4.4 IMMUNISIERUNG MIT XCL1-OVA VERHINDERT DAS WACHSTUM EINES TUMORS 59
3.5 XCRL-EXPRESSION IM MENSCHEN 60
3.5.1 XCR1 WIRD IM MENSCHLICHEN BLUT NUR AUF CD141 + DENDRITISCHEN
ZELLEN EXPRIMIERT 61
3.5.2 ETABLIERUNG EINER STRATEGIE ZUM GLEICHZEITIGEN SORTIEREN ALLER
POPULATIONEN DER DENDRITISCHEN
ZELLEN AUS HUMANEM BLUT 62
3.5.3 CD 141 + DENDRITISCHE ZELLEN MIGRIEREN ALS EINZIGE ZELLEN ZU XCLI
63
4 DISKUSSION 66
4.1 GENERIERUNG EINES XCRL-SPEZIFISCHEN MONOKLONALEN ANTIKOERPERS 66
4.2 XCRL-EXPRESSION 67
4.3 INTERAKTION VON XCR1 UND XCLI 70
4.4 ANTIGENBELADUNG KREUZPRAESENTIERENDER DENDRITISCHER ZELLEN UEBER XCR1
72
5 ZUSAMMENFASSUNG/SUMMARY 78
5.1 ZUSAMMENFASSUNG 78
5.2 SUMMARY 79
6 LITERATURVERZEICHNIS 80
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 93
8 DANKSAGUNG 95
9 PUBLIKATIONEN 96
9.1 ORIGINALPUBLIKATIONEN 96
9.2 KONGRESSBEITRAEGE UND SONSTIGE VORTRAEGE 96
III
|
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