Eine kritische Evaluierung FRET-basierter Biosensoren als Werkzeuge für die quantitative Metabolitanalytik:
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Jülich
Forschungszentrum Jülich
2012
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INHALTSVERZEICHNIS
I. ABSTRACT 6
II. KURZFASSUNG 7
III. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 8
IV. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 9
V. TABELLENVERZEICHNIS 13
1 EINLEITUNG 14
1.1 GRUNDLAGEN D E R FLUORESZENZ 14
1.1.1 FOERSTER-RESONANZENERGIETRANSFER (FRET) 16
1.1.2 FLUORESZENZLEBENSDAUER MESSUNGEN 17
1.2 FLUORESZIERENDE PROTEINE 18
1.2.1 DAS GRUEN FLUORESZIERENDE PROTEIN (GFP) AUS AEQUOREA VICTORIA 18
1.2.2 FLAVIN-MONONUCLEOTID-BASIERTES FLUORESZENZPROTEIN (FBFP) 20
1.3 PERIPLASMATISCHE BINDEPROTEINE 21
1.3.1 D-GALACTOSE/ D-GLUCOSE-BINDEPROTEIN (GGBP) 22
1.3.2 MALTOSE-BINDEPROTEIN (MBP) 23
1.4 GENETISCH KODIERTE FRET-BIOSENSOREN 2 4
1.5 MAKROMOLECULAR CROWDING 2 7
2 ZIELSETZUNG 31
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 33
3.1 CHARAKTERISIERUNG DER GEREINIGTEN SENSORPROTEINE 33
3.1.1 KULTIVIERUNG BIOSENSOREN 33
3.2 CHARAKTERISIERUNG DER BIOSENSOREN U N D FLUORESZENZPROTEINE 3 5
3.2.1 EINFLUSS DES PH-WERTS AUF DAS SENSORSIGNAL 35
3.2.2 EINFLUSS DER LONENSTAERKE AUF DAS SENSORSIGNAL 38
3.2.3 EINFLUSS VERSCHIEDENER PUFFERSALZE AUF DAS SENSORSIGNAL 39
3.2.4 EINFLUSS VON SALZEN UND SPURENELEMENTEN AUF DAS SENSORSIGNAL 40
3.2.5 EINFLUSS VERSCHIEDENER ZELLMETABOLITE AUF DAS SENSORSIGNAL 44
4
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3.2.6 MESSUNGEN IN E. COLI ROHZELLEXTRAKT 52
3.2.7 EINFLUSS VON MOLECULAR CROWDING AUF DIE AFFINITAET DER BIOSENSOREN
55
3.2.8 FCFBFP ALS ALTERNATIVER FRET-DONOR 63
3.2.9 NEUE SENSORKONSTRUKTE 67
3.2.10 PHOTOPHYSIKALISCHE BEOBACHTUNGEN 70
4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION UND AUSBLICK 73
5 MATERIAL UND METHODEN 78
5. 1 GERAETE 78
5.2 CHEMIKALIEN 8 0
5.3 MEDIEN, PUFFER UND LOESUNGEN 8 1
5.4 BIOLOGISCHES M A T E R I A L 85
5.5 KULTIVIERUNG UND REINIGUNG DER BIOSENSOR-PROTEINE 9 0
5.6 ANALYTIK 93
6 ANHANG 100
7 ERKLAERUNG 105
8 LITERATURVERZEICHNIS 107
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