Etablierung eines dreidimensionalen Kokultur-Modells zur Untersuchung der RPE-induzierten Angiogenese in vitro:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2012
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5
1 EINLEITUNG 8
2 ZIEL DER ARBEIT 14
3 MATERIAL UND METHODEN 15
3.1 ZELLISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG 15
3.1.1 KULTIVIERUNG VON HUMANEN UMBILIKALVENEN-ENDOTHELZELLEN UND HUMANEN
MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN 15
3.1.2 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG VON PRIMAEREN HUMANEN RETINALEN
PIGMENTEPITHELZELLEN (HRPE) 16
3.2 RT-PCR VON RPE-MARKERN 17
3.3 DREIDIMENSIONALER SPROUTING ASSAY 18
3.3.1 HERSTELLUNG VON METHOCEL 18
3.3.2 ENDOTHELZELLSPHAEROIDE 18
3.3.3 ISOLIERUNG VON KOLLAGEN TYP I 19
3.3.4 AUSSIEDELN VON MONOLAYERN 19
3.3.5 KOLLAGENEINBETTUNG VON ENDOTHELZELLSPHAEROIDEN 20
3.3.6 AUSWERTUNG 21
3.4 QUANTIFIZIERUNG DER WACHSTUMSFAKTORSEKRETION VON RPE-ZELLEN MIT
ELISA 21
3.4.1 VEGF- UND FGF2-ELISA AUS DEM ZELLKULTUR-UEBERSTAND 21
3.4.2 MESSUNG DES GESAMTPROTEINS MITTELS MIKRO BCA-TEST 22
3.5 DETEKTION DER APOPTOSE IM SPHAEROID 22
3.5.1 PRAEPARATION DER KOLLAGEN-GELE FUER DIE KONFOKALE MIKROSKOPIE 22
3.5.2 KOLLAGENASE-VERDAU DER GELE FUER DEN APOPTOSE- ASSAY 23
3.5.3 CELL DEATH DETECTION ELISA 23
4 ERGEBNISSE 25
4.1 NACHWEIS DER EXPRESSION VON RPE-MARKERN MITTELS RT-PCR 25
4.2 WECHSELWIRKUNG VON RPE-ZELLEN UND ENDOTHELZELLSPHAEROIDEN 26
4.2.1 WIRKUNG DER RPE-MONOLAYER AUF ENDOTHELZELLSPHAEROIDE IM
DREIDIMENSIONALEN
SPROUTING-ASSAY 26
4.2.2 EXPRESSION VON VEGF UND FGF2 IN NORMALEM UND CNV-RPE 27
4.2.3 WIRKUNG VON ANTI-VEGF UND ANTI-FGF-ANTIKOERPERN AUF DAS
RPE-INDUZIERTE
SPROUTING VON ENDOTHELZELL-SPHAEROIDEN 28
4.3 BEEINFLUSSUNG DES PI3K-SIGNALWEGES 31
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IMAGE 2
6
4.3.1 WIRKUNG EINER PI3K-INHIBITION AUF DAS RPE-INDUZIERTE SPROUTING VON
ECSPHAEROIDEN 31
4.3.2 BEEINFLUSSUNG DER APOPTOSE VON ENDOTHELZELLEN INNERHALB DES
SPHAEROIDS DURCH
LY294002 UND ZV AD 32
4.3.3 WIRKUNG DER PI3K-INHIBITION AUF DIE VEGF-EXPRESSION VON RPE-ZELLEN
35
4.3.4 WIRKUNG VON RAPAMYCIN AUF DAS RPE-INDUZIERTE SPROUTING VON
EC-SPHAEROIDEN. 36
4.3.5 MESSUNG DER APOPTOSE VON ENDOTHELZELLEN IM SPHAEROID NACH
INKUBATION MIT
RAPAMYCIN 37
4.3.6 BEEINFLUSSUNG DER VEGF-EXPRESSION VON RPE-ZELLEN DURCH RAPAMYCIN
39
5 DISKUSSION 42
5.1 ENTWICKLUNG EINES DREIDIMENSIONALEN KOKULTUR-MODELLS VON
ENDOTHELZELLSPHAEROIDEN
UND RPE-MONOLAYERN 42
5.2 INTERAKTION ZWISCHEN ENDOTHELZELLEN UND RPE-MONOLAYERN IM
KOKULTUR-MODELL 44
5.3 WIRKUNG EINER VEGF- UND VEGF-REZEPTOR-INHIBITION AUF DIE INTERAKTION
DER ZELLEN IM
KOKULTUR-MODELL 45
5.4 WIRKUNG EINER FGF2-INHIBITION SOWIE EINER KOMBINATIONSTHERAPIE AUF
DIE RPEINDUZIERTE ENDOTHELZELLSPROSSUNG 46
5.5 WIRKUNG EINER BLOCKADE VERSCHIEDENER EBENEN DES PI3K7AKT-SIGNALWEGES
AUF DIE
ZELLINTERAKTION IM KOKULTUR-MODELL 47
5.6 BEDEUTUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT FUER DIE CNV-FORSCHUNG UND AUSBLICK
AUF DIE
WEITERE ENTWICKLUNG 50
6 ZUSAMMENFASSUNG 53
7 LITERATUR 54
8 DANKSAGUNGEN 60
9 LEBENSLAUF 61
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