Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern der Gephyrin C-Domäne:
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| adam_text | Titel: Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionspartnern der Gephyrin C-Domäne
Autor: Keib, Natalie
Jahr: 2012
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Neuronale Signalweiterleitung 1
1.2 Aufbau und Funktion inhibitorischer Rezeptoren 2
1.3 Aufbau und Funktion von Gephyrin 4
1.4 Alternatives Spleißen von Gephyrin 7
1.5 Interaktion von Gephyrin mit dem Glycin-Rezeptor 9
1.6 Interaktion von Gephyrin mit dem GABAA-Rezeptor 11
1.7 Phosphorylierungsabhängige Regulation der Gephyrin-Clusterung 12
1.8 Regulation der Gephyrin-Clusterung durch Collybistin und Zelladhäsionsmoleküle
(CAMs) 14
1.9 Interaktion von Gephyrin mit dem Zytoskelett 16
1.10 Zielsetzung 17
2 Ergebnisse 20
2.1 Identifizierung von Interaktionspartnern der Gephyrin C-Domäne 20
2.1.1 Anreicherung von Interaktionspartnern der Gephyrin C-Domäne 20
2.1.2 TMT-Labeling, Identifizierung und Quantifizierung von
Interaktionspartnerkandklaten der Gephyrin C-Domäne 22
2.1.3 Label-freie Identifizierung und Quantifizierung von
Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne 25
2.1.4 Ingenuity Netzwerkanalyse 27
2.2 Charakterisierung der Interaktion von Gephyrin mit der Peptidyl-prolyl-cis-trans-
Isomerase A 32
2.2.1 Expression und Reinigung von PPIase A 32
2.2.2 Komplexbildung der Gephyrin C-Domäne und PPIase A 33
2.2.3 Kolokalisation von PPIase A mit Gephyrin in COS7-Zellen 35
2.2.4 Kolokalisation von PPIase A mit Gephyrin Spleiß-Varianten in COS7-Zellen 37
2.2.5 Kolokalisation von Pin1 und Gephyrin in COS7-Zellen 37
2.2.6 Identifizierung des PPIase A Bindemotivs auf Gephyrin 39
2.2.7 Effekt der PPIase A Überexpression auf die Gephyrin-Clusterung
in hippocampalen Neuronen 41
2.3 Charakterisierung der Interaktion von Gephyrin mit Calcineurin . 44
2.3.1 Verifizierung der Gephyrin-Calcineurin Interaktion 46
2.3.2 Dephosphorylierung von Gephyrin durch Calcineurin 49
; 2.3.3 Effekt der Calcineürin-Überexpression auf die Gephyrin-Clusterung
in hippocampalen Neuronen 52
2.4 Charakterisierung von Gephyrin-APP 54
2.4.1 Oberexpression der GephyrinC4c-APP-Variante in COS7-Zellen 54
2.4.2 Kolokalisationsanalyse der GephyrinC4c-APP-Variante mit bekannten
Interaktionspartnern von Gephyrin 56
2.4.3 Expression und Reinigung der GephyrinC4c-APP-Variante 57
2.4.4 Analyse der Faltung der GephyrinC4c-APP-Variante 58
2.4.5 Bestimmung der Moco-synthetischen Aktivität der GephyrinC4c-APP-Variante 59
2.4.6 Effekt der PolyproHnregion-Deletion auf die Gephyrin-Clusterung in
hippocampalen Mausneuronen 61
3 Diskussion 63
3.1 Identifizierung von Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne 63
3.1.1 TMT-Label-basierte Identifizierung von Interaktionspartnerkandidaten
im Vergleich zu anderen Methoden der Interaktionspartnersuche 63
3.1.2 Funktionsanalyse der Interaktionspartnerkandidaten 67
3.2 Regulation der Gephyrin-Clusterung durch PPIase A 73
3.3 Regulation der Gephyrin-Clusterung durch Calcineurin 76
3.4 Bedeutung der Polyprolinregion der Gephyrin C-Domäne für
die Aggregation und Clusterung von Gephyrin 81
3.5 Regulationsmodell der Gephyrin-Clusterung durch PPIase A und Calcineurin 82
4 Material und Methoden 84
4.1 Materialien 84
4.1.1 Enzyme und Chemikalien 84
4.1.2 Antikörper 84
4.1.3 Organismen und Stämme 85
4.1.4 Plasmide 85
4.2 Molekularbiologische Methoden 85
4.2.1 Klonierung 85
4.2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 86
4.3 Biochemische Methoden 86
4.3.1 Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli 86
4.3.2 Überexpression rekombinanter Proteine in Sf9-Insektenzellen 87
4.3.3 Zellaufschluss und Proteinextraktton 87
4.3.4 Affinitätschromatographie Intein/CBD-fusionierter Proteine 88
4.3.5 Affinitätschromatographie Histidin-fusionierter Proteine 88
4.3.6 Anionenaustauschchromatographie 89
4.3.7 Größenausschlusschromatographie 89
4.3.8 Konzentrationsbestimmung von Proteinen 89
4.3.9 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 90
4.3.10 Westemblot-Analyse 90
4.3.11 Herstellung von Maushimextakt 91
4.4 Analytische Methoden 91
4.4.1 Kosedimentation mit Intein/CBD-fusionierten Gephyrin
C-Domäne Spleiß-Varianten 91
4.4.2 TMT-Labeling der angereicherten Interaktionspartner der Gephyrin
C-Domäne Spleiß-Varianten 92
4.4.3 NanoLC-ESI-MS/MS 94
4.4.4 Label-freie Quantifizierung 93
4.4.5 Datenanalyse der NanoLC-ESI-MS/MS-Messung 93
4.4.6 TMT-Quantifrzierung 94
4.4.7 Identifizierung der dephosphorylierten Gephyrin-Reste 94
4.4.8 Koimmunpräzipitation 95
4.4.9 Crosslinking 95
4.4.10 Differenz-Scanning-Kabrimetrie(DSC) 95
4.4.11 Calcineurin-Phosphatase Assay 96
4.4.12 Bestimmung der Moco-synthetischen Aktivität von Gephyrin 97
4.4.13 Ferricyanid-Assay 98
4.5 Zellbiologische Methoden 98
4.5.1 Kultivierung von Sf9-Insektenzellen 98
4.5.2 Kultivierung von COS7-Zellen 98
4.5.3 Transiente Transfektion von COS7-Zellen 98
4.5.4 Kultivierung und Transfektion der hippocampalen Mausneuronen 99
4.5.5 Behandlung der hippocampalen Neurone mit Inhibitoren 99
4.5.6 Immunfärbung von COS7-Zellen 99
4.5.7 Immunfärbung der hippocampalen Neurone 100
4.5.8 Mikroskopie und Quantifizierung 100
5 Anhang 101
5.1 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne
Spleiß-Varianten bei der TMT-basierten Interaktionspartnersuche 101
5.1.1 Die identifizierten Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne
ohne Spleiß-Kassetten Insertion 101
5.1.2 Die identifizierten Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC3 103
5.1.3 Die identifizierten Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC4c 105
5.1.4 Die identifizierten Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC4a 107
5.2 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne
Spleiß-Varianten bei der Label-freien Interaktionspartnersuche 108
5.2.1 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-Domäne
ohne Spließ-Kassetten Insertion 108
5.2.2 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC3 110
5.2.3 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC4c 111
5.2.4 Identifizierte Interaktionspartnerkandidaten der Gephyrin C-DomäneC4a 112
5.3 Sequenzen 113
5.3.1 Gephyrin-Sequenz 113
5.3.2 PPIase A-Sequenz 116
5.3.3 Sequenz der katalytischen Untereinheit von Calcineurin 116
5.4 Konstrukt- und Primerliste 117
6 Referenzen 118
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