Untersuchung der Mth60-Fimbrien von Methanothermobacter thermoautotrophicus:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG 1
II MATERIAL UND METHODEN 10
1 BEZUGSQUELLEN 10
1.1 CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 10
1.2 REAKTIONSKITS UND CHROMATOGRAPHIESAEULEN 11
1.3 ENZYME 12
1.4 MOLEKULARMASSENSTANDARDS UND LADEPUFFER 12
1.5 VEKTOR UND OLIGONUKLEOTIDE 12
1.6 ANTIKOERPER 13
1.7 VERBRAUCHSMATERIALIEN 14
1.8 GLASWAREN 15
1.9 GERAETE 15
1.10 ORGANISMEN 16
2 KULTURMEDIEN UND ANZUCHT DER MIKROORGANISMEN 17
2.1 MS-MEDIUM (BALCH ETAL., 1979), MODIFIZIERT 17
2.1.1 ZUSAMMENSETZUNG DES MS-KULTURMEDIUMS 17
2.1.2 HERSTELLUNG IM LABORMASSSTAB 19
2.1.3 GROSSTECHNISCHE HERSTELLUNG IM FERMENTER 19
2.1.4 KULTIVIERUNG DER ORGANISMEN 19
2.1.5 ANZUCHT AUF FESTEN OBERFLAECHEN 20
2.2 LB-MEDIUM (MILLER, 1972) 20
2.2.1 ZUSAMMENSETZUNG DES LB-KULTURMEDIUMS 20
2.2.2 HERSTELLUNG ALS FLUESSIGMEDIUM UND AGARPLATTEN 20
2.2.3 KULTIVIERUNG 21
3 STERILISATION 21
4 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 21
4.1 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA 21
4.1.1 ZELLAUFSCHLUSS 22
4.1.2 ISOLIERUNG UND REINIGUNG DER DNA 22
4.2 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 23
4.2.1 HINWEISE ZUR ARBEIT MIT RNA 23
4.2.2 ZELLAUFSCHLUSS 23
4.2.3 ISOLIERUNG UND REINIGUNG DER RNA 24
4.3 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 24
4.4 REVERSE TRANSKRIPTION 24
4.5 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 25
4.6 POLYMERASE-CHAIN-REACTION (PCR) 26
4.6.1 STANDARD-PCR FUER ANSCHLIESSENDE KLONIERUNG 26
4.6.2 QUANTITATIVE REVERSE-TRANSKRIPTIONS-PCR (QRT-PCR) 27
4.6.2.1 UEBERPRUEFUNG DER QUALITAET DER PRIMERPAARE 27
4.6.2.2 ANALYSE DER TRANSKRIPTMENGEN 28
4.7 KLONIERUNG 29
4.7.1 RESTRIKTIONSHYDROLYSE 29
4.7.2 LIGATION 29
4.7.3 HERSTELLUNG KOMPETENTER ZELLEN 30
4.7.4 TRANSFORMATION IN KOMPETENTE E. COLI- ZELLEN 30
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4.7.5 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 31
4.7.6 SCREENING DER KLONE 31
4.7.7 DNA-SEQUENZIERUNG UND SEQUENZDATENANALYSE 31
4.7.8 ANLEGEN VON GLYCERINKULTUREN 31
4.7.9 ERSTELLUNG UND KLONIERUNG DES GENKONSTRUKTES MTH60/MTH59 32
5 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 32
5.1 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG VON FIMBRIEN 32
5.1.1 ZELLERNTE 32
5.1.2 ISOLIERUNG UEBER ULTRA-TURRAX-BEHANDLUNG 33
5.1.3 ISOLIERUNG AUS DEM ZENTRIFUGATIONSUEBERSTAND 33
5.1.4 ISOLIERUNG MITTELS PSEUDOMURAMIDASE PEIP 33
5.1.5 CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 34
5.1.6 DIALYSE DER FRAKTIONEN 34
5.2 ZELLAUFSCHLUSS ZUR ANALYSE VON PROTEINEN 34
5.3 HETEROLOGE GENEXPRESSION IN E. COLI 35
5.3.1 INDUKTION DER PROTEINEXPRESSION 36
5.3.2 AUFREINIGUNG UEBER AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 37
5.3.2.1 NICKEL-CHELAT-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 37
5.3.2.2 ANTIKOERPER-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 37
5.3.3 DIALYSE 38
5.3.4 ABSPALTUNG DES HIS-TAGS 38
5.4 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN 39
5.5 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 39
5.5.1 HERSTELLUNG DER GELE 39
5.5.2 DISKONTINUIERLICHE SDS-PAGE NACH LAEMMLI (1970) 40
5.5.3 DISKONTINUIERLICHE SDS-PAGE NACH SCHAEGGER UND JAGOW (1987) 40
5.5.4 PROBENVORBEREITUNG UND ELEKTROPHORESEBEDINGUNGEN 40
5.5.5 FAERBUNG VON SDS-GELEN 41
5.5.6 TROCKNUNG VON SDS-GELEN 42
5.6 WESTERN BLOT 42
5.6.1 TRANSFER DER PROTEINE AUF PVDF-MEMBRAN (TOWBIN ETAT., 1979) 42
5.6.2 FAERBUNG MIT PONCEAU S 43
5.6.3 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS 43
5.7 POLYMERISATIONSSTUDIEN 44
5.8 UNTERSUCHUNG VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN 45
5.8.1 CO-IMMUNPRAEZIPITATION 45
5.8.1.1 BINDUNG DER ANTIKOERPER AN DAS SAEULENMATERIAL 45
5.8.1.2 VORBEREITUNG DER PROTEINLOESUNGEN 46
5.8.1.3 DURCHFUEHRUNG DER CO-IMMUNPRAEZIPITATION UND ELUTION 46
5.8.2 GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE 46
5.9 IDENTIFIZIERUNG VON PROTEINEN 47
5.9.1 N-TERMINALE SEQUENZIERUNG UEBER EDMAN-ABBAU 47
5.9.2 PROTEOLYTISCHER IN-GEL-VERDAU UND MALDI-TOF MS/MS 47
5.9.3 LC/MS 48
5.10 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 48
6 MIKROSKOPIE 49
6.1 PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE 49
6.2 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (TEM) 49
6.3 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE (REM) 50
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
7 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE PRAEPARATIONSTECHNIKEN 50
7.1 HERSTELLUNG UND KONTRASTIERUNG VON SUSPENSIONSPRAEPARATEN 50
7.2 HERSTELLUNG VON ULTRADUENNSCHNITTEN 51
7.2.1 PROBENVORBEREITUNG UND HIGH PRESSURE FREEZING (HPF) 51
7.2.2 GEFRIERSUBSTITUTION 51
7.2.3 INFILTRATION UND EINBETTUNG 52
7.2.4 VORBEREITUNG DER EINGEBETTETEN PROBEN 53
7.2.5 ULTRAMIKROTOMIE 53
7.3 IMMUNMARKIERUNG FUER DIE ELEKTRONENMIKROSKOPIE 53
7.3.1 IMMUNMARKIERUNG AN SUSPENSIONSPRAEPARATEN UND BEWACHSENEN
GOLD-GRIDS.. 54 7.3.2 IMMUNMARKIERUNG AN ULTRADUENNSCHNITTEN 55
8 GENERIERUNG UND AUFREINIGUNG POLYKLONALER ANTIKOERPER 56
8.1 GENERIERUNG PRIMAERER ANTIKOERPER GEGEN MTH59 56
8.2 GENERIERUNG PRIMAERER ANTIKOERPER GEGEN DIE MTH60-FIMBRIEN 56
8.3 AUFREINIGUNG POLYKLONALER KANINCHEN IGG-ANTIKOERPER 56
8.4 AUFREINIGUNG POLYKLONALER HUHN IGY-ANTIKOERPER 57
III ERGEBNISSE 58
1 BESTIMMUNG DER TRANSKRIPTMENGEN DER MF/ 60-GENCLUSTER 58 1.1
RNA-ISOLIERUNG UND REVERSE TRANSKRIPTION 58
1.2 BESTIMMUNG DER EFFIZIENZ DER PRIMERPAARE 59
1.3 UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTMENGEN 59
2 BIOINFORMATISCHE ANALYSEN 61
3 KLONIERUNG UND EXPRESSION 64
3.1 KLONIERUNG UND EXPRESSION DER GENSEQUENZ MTH61-MTH58 64
3.2 KLONIERUNG UND EXPRESSION DES GENKONSTRUKTES MTH60/MTH59 65
3.3 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON MTH59 SOWIE ANTIKOERPERGENERIERUNG 69
3.4 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON MTH61 71
3.5 KLONIERUNG UND EXPRESSION VON MTH58 71
3.6 EXPRESSION DER PSEUDOMUREIN-ENDOISOPEPTIDASE PEIP 72
4 CHARAKTERISIERUNG DER MTH60-FIMBRIEN VON M. THERMOAUTOTROPHICUS 72 4.1
ISOLIERUNG UND ANALYSE DER FIMBRIEN 72
4.1.1 ISOLIERUNG AUS DEM ZELLPELLET MITTELS ULTRA-TURRAX 72
4.1.2 ISOLIERUNG AUS DEM ZENTRIFUGATIONSUEBERSTAND UEBER PEG-FAELLUNG 73
4.1.3 ISOLIERUNG AUS DEM ZELLPELLET MITTELS PSEUDOMURAMIDASE PEIP 75 4.2
VERSUCHE ZUR IDENTIFIZIERUNG WEITERER FIMBRIENPROTEINE 76
4.3 ELEKTRONENMIKROSKOPIE DER FIMBRIEN ADHAERENTER ZELLEN 78
4.3.1 T RANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 78
4.3.2 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE 81
4.4 GENERIERUNG, AUFREINIGUNG UND ANALYSE VON ANTI-MTH60-FIMBRIEN
ANTIKOERPER 81 4.5 IMMUNMARKIERUNGEN MIT ANTI-MTH60-FIMBRIEN ANTIKOERPER
82
5 UNTERSUCHUNG DER ZELLANHAENGE VERWANDTER METHANOGENER ARCHAEEN 86 5.1
ISOLIERUNG UND ANALYSE DER FIMBRIEN VON M. MARBURGENSIS 86
5.1.1 ISOLIERUNG UEBER PEG-FAELLUNG 86
5.1.2 ISOLIERUNG UEBER BEHANDLUNG MIT PEIP 87
5.2 ISOLIERUNG UND ANALYSE DER FIMBRIEN VON M. FERVIDUS 88
5.2.1 ISOLIERUNG UEBER PEG-FAELLUNG 89
5.2.2 ISOLIERUNG UEBER BEHANDLUNG MIT PEIP 89
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.3 VERSUCHE ZUR IDENTIFIZIERUNG DER FIMBRINE 90
5.4 UEBERPRUEFUNG AUF KREUZREAKTIONEN MIT ANTI-MTH60-FIMBRIEN ANTIKOERPER
91
6 STUDIEN ZUR FUNKTION UND LOKAIISATION VON MTH59 92
6.1 UEBERPRUEFUNG DER FUNKTION VON MTH59 92
6.1.1 CO-IMMUNPRAEZIPITATIONEN 92
6.1.2 GELFILTRATIONS-CHROMATOGRAPHIE 97
6.2 UEBERPRUEFUNG DER LOKAIISATION VON MTH59 98
6.2.1 IMMUNMARKIERUNGEN AN ELEKTRONENMIKROSKOPISCHEN PRAEPARATEN 98 6.2.2
IMMUNMARKIERUNGEN AN WESTERN- UND DOT BLOTS 98
7 POLYMERISATIONSSTUDIEN 100
7.1 VARIATION VON TEMPERATUR UND INKUBATIONSDAUER 100
7.2 EINFLUSS ZWEIWERTIGER IONEN 105
7.3 EINFLUSS VON MTH59 108
IV DISKUSSION 111
1 QUANTITATIVE ANALYSEN DER MIT MTHSSO CO-TRANSKRIBIERTEN GENE 111
2 CHARAKTERISIERUNG DER MTH60-FIMBRIEN VON M. THERMOAUTOTROPHICUS 116
2.1 ISOLIERUNG DER MTH60-FIMBRIEN 116
2.2 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSE DER MTH60-FIMBRIEN 117
2.2.1 ULTRASTRUKTUR 117
2.2.2 DUENNERE FILAMENTE 118
2.2.3 ENDSTAENDIGE STRUKTUREN 119
2.2.4 IMMUNMARKIERUNGEN MIT FIMBRIEN-SPEZIFISCHEN ANTIKOERPERN 120 2.2.5
LEITERAEHNLICHE STRUKTUREN 121
2.3 VERSUCHE ZUR IDENTIFIZIERUNG DER FIMBRIEN-PROTEINE 122
2.4 VERGLEICH DER MTH60-FIMBRIEN MIT DEN FIMBRIEN VERWANDTER
METHANOGENER 123
3 HETEROLOGE GENEXPRESSION IN E. COLI 125
4 MTH59 UND SEINE FUNKTION BEI DER ASSEMBLIERUNG DER MTH60-FIMBRIEN 127
5 POLYMERISATIONSSTUDIEN 131
6 FAZIT 135
V ZUSAMMENFASSUNG 137
VI ANHANG 139
1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 139
2 NUKLEOTID- UND AMINOSAEURESEQUENZEN 140
3 AUSWERTUNG DER QRT-PCR 141
4 ERGAENZENDE ABBILDUNGEN 143
5 BEGLEIT-CD 145
VII LITERATURVERZEICHNIS 146
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