Identifizierung neuer antiviraler Wirkstoffe und Charakterisierung der Chikungunya nsP2-Protease:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 GESCHICHTE DES CHIKUNGUNYA-VIRUS 1
1.2 UEBERTRAGUNG DES CHIKUNGUNYA-VIRUS 3
1.3 GENOMSTRUKTUR UND ORGANISATION 3
1.4 REPLIKATIONSZYKLUS 5
1.5 KLINISCHE ERSCHEINUNGEN 6
1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 9
2 MATERIALIEN 10
2.1 CHEMIKALIEN 10
2.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN UND GERAETE 11
2.3 RESTRIKTIONSENZYME 12
2.4 ANTIKOERPER 12
2.5 ANTIBIOTIKA 12
2.6 VEKTOREN 12
2.7 OLIGONUKLEOTIDE 13
2.8 KITS 13
2.9 BAKTERIENSTAEMME/KOMPETENTE ZELLEN 13
2.10 ZELLKULTUR 13
2.11 MEDIEN, LOESUNGEN UND PUFFER 13
2.11.1 BAKTERIENKULTUREN 13
I
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IMAGE 2
2.11.2 PUFFER UND LOESUNGEN FUER ANALYSE UND KLONIERUNG VON DNA 14
2.11.3 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE DENATURIERENDE PROTEINAUFREINIGUNG 14
2.11.4 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE NATIVE PROTEINAUFREINIGUNG 15
2.11.5 PUFFER UND LOESUNGEN FUER DIE PROTEINANALYSE 15
3 METHODEN 17
3.1 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 17
3.1.1 ANZUCHT UND INFIZIERUNG VON VERA-ZEILEN 17
3.2 METHODEN ZUR HERSTELLUNG UND KULTIVIERUNG VON DNA 18
3.2.1 HERSTELLUNG DER KOMPETENTEN BAKTERIEN 18
3.2.2 TRANSFORMATION KOMPETENTER ZELLEN 18
3.2.3 KULTIVIERUNG VON BAKTERIENSTAEMMEN 19
3.2.4 MINIPRAEPARATION 19
3.2.5 MAXIPRAEPARATION DER BAKTERIELLEN PLASMID-DNA 20
3.2.6 SPEKTRAIPHOTOMETRISCHE ANALYSE DES NUKLEINSAEUREGEHALTS 21
3.2.7 SPALTUNG DER DNA DURCH RESTRIKTIONSENZYME # . 22
3.2.8 DNAANALYSE DURCH AGAROSEGELELEKTROPHORESE 22
3.2.9 ISOLIERUNG DER DNA-FRAGMENTE AUS EINEM AGAROSEGEL 23
3.2.10 PCR 23
3.2.11 AUFREINIGUNG DER DNA 24
3.2.12 KLONIERUNG DES AUFGEREINIGTEN PCR-PRODUKTS 25
3.2.13 SEQUENZIERUNG 26
3.3 PROTEINEXPRESSION UND AUFREINIGUNG 27
II
IMAGE 3
3.3.1 PROTEINEXPRESSION 27
3.3.2 DENATURIERENDE PROTEINAUFREINIGUNG 27
3.3.3 NATIVE PROTEINAUFREINIGUNG DER NI-NTAAGAROSE MATRIX 28
3.3.4 DIALYSE DER PROTEINE 29
3.4 METHODEN ZUM NACHWEIS UND ZUR ANALYSE VON PROTEINEN 30
3.4.1 SDS-PAGE UND COOMASSIE-BLAU FAERBUNG 30
3.4.2 WESTERN BLOT 32
3.4.3 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 34
4 ERGEBNISSE 35
4.1 ENTWICKLUNG NEUER PROTEASE INHIBITOREN 35
4.1.1 VERWENDETE INHIBITOREN 35
4.1.2 TOXIZITAETSTEST 35
4.1.3 KONTROLLUNTERSUCHUNGEN 39
4.1.4 INHIBITION DES CHIKUNGUNYA-VIRUS 41
4.2 EXPRESSION UAD AUFREINIGUNG DER CHIKUNGUNYA PROTEASE 49
4.2.1 EXPRESSION DER CHIKUNGUNYA PROTEASE 49
4.2.2 DENATURIERENDE AUFREINIGUNG DER CHIKUNGUNYA PROTEASE 50
4.2.3 NATIVE AUFREINIGUNG DER CHIKUNGUNYA PROTEASE 53
4.3 IDENTIFIZIERUNG DER NSP2-PROTEASE 55
5 DISKUSSION 57
5.1 ANALYSE DER WIRKUNG DER ANTIVIRALEN WIRKSTOFFE AUF DIE ZELLEN UND
DAS CHIKUNGUNYA-VIRUS 60
III
IMAGE 4
6 ZUSAMMENFASSUNG 62
7 ANHANG 64
7.1 LITERATURVERZEICHNIS 64
7.2 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 79
7.3 TABELLENVERZEICHNIS 81
7.4 ABKUERZUNGSVERAEICHNIS 81
DANKSAGUNG 85
IV
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