Modulation der Genexpression von CXCL10 und immunorelevanter MicroRNAs durch neue Wirkstoffe aus Pilzen:
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WiKu-Verl.
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS IV
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS XI
1. EINLEITUNG 1
1.1 ENTZUENDUNGSREAKTIONEN 1
1.2 LNTERFERON-Y-INDUCIBLE-PROTEIN-10 (IP-10 / CXCL10) 2
1.3 BEDEUTUNG VON CXCL10 BEI INFEKTIONSERKRANKUNGEN 3
1.4 DIE BEDEUTUNG VON CXCL10 IN DER PATHOLOGIE DER RHEUMATOIDEN
ARTHRITIS 7
1.5 REGULATION DER CXCL10- PROMOTORAKTIVITAET 9
1.6 EINFLUSS VON MICRORNAS AUF DIE REGULATION DER GENEXPRESSION 10
1.7 BEDEUTUNG VON MIRNAS BEI DER PATHOGENESE DER RHEUMATOIDEN ARTHRITIS
13
2. ZIELSETZUNG DER ARBEIT 16
3. MATERIAL UND METHODEN 18
3.1 CHEMIKALIEN 18
3.2 MEDIEN, PUFFER UND LOESUNGEN 20
3.2.1 MEDIEN FUER PILZE UND BAKTERIEN 20
3.2.2 MEDIEN FUER ZELLKULTUREN 21
3.2.3 PUFFER UND LOESUNGEN 22
3.3 ENZYME 26
3.4 OLIGONUKLEOTIDE 26
3.4.1 PCR-PRIMER 26
3.4.2 REAL TIME PCR-PRIMER MRNA-EXPRESSION 26
3.4.3 REAL TIME PCR-PRIMER MIRNA-EXPRESSION 28
3.5 PLASMIDE 28
3.6 ORGANISMEN 32
3.6.1 BEARBEITETE PILZSTAEMME 32
3.6.2 BAKTERIEN FUER DIE TRANSFORMATION 32
3.6.3 ZELLLINIEN 32
3.6.4 TESTORGANISMEN FUER DIE BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG 33
3.7 VERMEHRUNG UND LAGERUNG VON ZELLLINIEN UND BAKTERIEN 33
3.7.1 KULTIVIERUNG DER EUKARYONTISCHEN ZELLLINIEN 33
IV
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.2 AUFBEWAHRUNG DER BAKTERIENKULTUREN 34
3.8 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 34
3.8.1 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI-ZELLEN (TOP
10F ) 34
3.8.2 PRAEPARATION VON NUKLEINSAEUREN 35
3.8.2.1 PLASMID-MINIPRAEPARATION 35
3.8.2.2 PLASMID-MAXIPRAEPARATION 35
3.8.2.3 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA AUS PILZEN 36
3.8.2.4 ISOLIERUNG VON RNA AUS HUMANEN ZELLLINIEN 36
3.8.2.5 ISOLIERUNG VON MICRORNA AUS HUMANEN ZELLLINIEN 36
3.8.2.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 36
3.8.3 RESTRIKTION UND GELELEKTROPHORESE 37
3.8.3.1 RESTRIKTION VON DNA 37
3.8.3.2 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE VON DNA 37
3.8.3.3 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN UND PCRPRODUKTEN AUS AGAROSEGELEN
38
3.8.3.4 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN 38
3.8.3.5 POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE VON DNA 38
3.8.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 38
3.8.4.1 ITS ( INTERNAL TRANSCRIBED SPACER REGION ) SEQUENZANALYSE AUS
PILZEN 38
3.8.4.2 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 39
3.8.5 SEQUENZIERUNG VON DNA 43
3.9 KULTIVIERUNG VON PILZEN IN SUBMERSKULTUR 43
3.9.1 FERMENTATION IN SCHUETTELKULTUR 43
3.9.2 FERMENTATION, PROBENAHME UND -AUFARBEITUNG DER PRODUZENTENSTAEMME
IM 20 I-MASSSTAB 43
3.10 FERMENTATIONSANALYSEN 44
3.10.1 PH-WERT 44
3.10.2 BESTIMMUNG DES GLUCOSEGEHALTS 44
3.10.3 MYZELTROCKENGEWICHT 45
3.10.4 WIRKSTOFFBESTIMMUNG MIT HILFE DER ANALYTISCHEN HPLC 45
3.10.5 BESTIMMUNG DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET 45
V
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.11 METHODEN ZUR REINIGUNG UND PHYSIKALISCH- CHEMISCHEN ANALYSE DER
WIRKSTOFFE 45
3.11.1 SAEULENCHROMATOGRAPHIE 45
3.11.2 HPLC- UND HPLC/MS-ANALYSE 46
3.11.3 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAPHIE 47
3.11.4 UV/VIS-, IR- UND NMR-SPEKTROSKOPIE 47
3.12 METHODEN ZUR BIOLOGISCHEN CHARAKTERISIERUNG 48
3.12.1 TRANSFEKTIONSMETHODEN 48
3.12.1.1 TRANSFEKTION VON C28/I2-ZELLEN MITTELS
LIPOFECTAMIN 48
3.12.1.2 ELEKTROPORATION VON MONOMAC6-ZELLEN 48
3.12.2 REPORTERGENASSAYS 49
3.12.2.1 CXCLIO-PROMOTOR KONTROLLIERTE REPORTERGENEXPRESSION 49
3.12.2.2 NF-KB-ABHAENGIGE SIGNALTRANSDUKTION 49
3.12.2.3 STAU-ABHAENGIGE SIGNALTRANSDUKTION 50
3.12.2.4 IRF-ABHAENGIGE SIGNALTRANSDUKTION 50
3.12.2.5 IL-8 PROMOTOR KONTROLLIERTE REPORTERGENEXPRESSION 50
3.12.2.6 MIR-34A-VERMITTELTE 3 UTR-ZIELSEQUENZBINDUNG 50
3.12.2.7 PRI-MIR-34A-PROMOTOR KONTROLLIERTE REPORTERGENEXPRESSION 50
3.12.2.8 DER DUAL-LUCIFERASE REPORTER-ASSAY 51
3.12.3 REAKTION MIT MODELLTHIOLEN 51
3.12.4 CYTOTOXIZITAETSTESTS 51
3.12.4.1 MIKROSKOPISCHE AUSWERTUNG 51
3.12.4.2 GIEMSA-FAERBUNG MIT MONOLAYERKULTUREN 51
3.12.4.3 XTT-TEST 52
3.12.5 WESTERN IMMUNOBLOTTING 52
3.12.5.1 UNTERSUCHUNG DER PHOSPHORYLIERUNG VON IRF3 53
3.12.5.2 NACHWEIS VON IRF3 54
3.12.5.3 UNTERSUCHUNG DER STAU-PHOSPHORYLIERUNG 54
3.12.5.4 UNTERSUCHUNG DER L-XB-DEGRADATION UND PHOSPHORYLIERUNG 54
VI
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.12.5.5 UNTERSUCHUNG DER CXCL10-PRODUKTION 55
3.12.6 PROTEOME PROFILING 56
3.12.7 IRF3-DNA BINDUNGS-ASSAY 56
3.12.8 CXCL10 ELISA 57
4. ERGEBNISSE 58
4.1. ETABLIERUNG EINES ASSAYSYSTEMS ZUR SUCHE NACH INHIBITOREN DER
HUMANEN CXCL10 PRODUKTION 58
4.1.1. DER REPORTERGENVEKTOR 58
4.2. SCREENING NACH INHIBITOREN DER CXCL10- PROMOTOR VERMITTELTEN
GENEXPRESSION 58
4.3 ISOLIERUNG VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) AUS GANODERMA APPLANATUM
09003 59
4.3.1 DER PRODUZENTENSTAMM GANODERMA APPLANATUM 09003 59
4.3.2 FERMENTATION VON G. APPLANATUM 09003 60
4.3.3 ISOLIERUNG VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) AUS G. APPLANATUM 09003
60
4.3.4 PHYSIKALISCH- CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON GANODERMYCIN 61
4.4 ISOLIERUNG VON MJ 09102-1 UND MJ 09102-2 AUS CRINIPELLIS SP. 09102
63
4.4.1 DER PRODUZENTENSTAMM CRINIPELLIS SP. 09102 63
4.4.2 FERMENTATION VON CRINIPELLIS SP. 09102 64
4.4.3 ISOLIERUNG VON MJ 09102-1 UND MJ 09102-2 AUS
CRINIPELLIS SP 09102 64
4.4.4 PHYSIKALISCH- CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON
MJ 09102-1 65
4.4.5 PHYSIKALISCH- CHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG VON
MJ 09102-2 67
4.5 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG DER VERBINDUNGEN 69
4.5.1 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) 69
4.5.1.1 WIRKUNG VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) AUF DIE CXCL10- PROMOTOR
ABHAENGIGE REPORTERGENEXPRESSION 69
VII
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
4.5.1.2 WIRKUNG VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) IN VERSCHIEDENEN
ENTZUENDUNGSRELEVANTEN REPORTERGENASSAYS
4.5.1.3 CYTOTOXIZITAETSTEST
4.5.1.4 EFFEKT VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) AUF DIE EXPRESSION PRO-
INFLAMMATORISCHER GENE (QUANTITATIVE REAL TIME PCR)
4.5.1.5 EFFEKT VON GANODERMYCIN (MJ 09003-1) AUF DIE CXCL10- PRODUKTION
UND ZELLVITALITAET
4.5.1.6 ANALYSE DES EINFLUSSES VON GANODERMYCIN AUF DIE SERIN-
PHOSPHORYLIERUNG VON IRF3 IN MONOMAC6 ZELLEN
4.5.1.7 UNTERSUCHUNG DES EFFEKTES VON GANODERMYCIN AUF DIE
STAT1-PHOSPHORYLIERUNG IN MONOMAC6 ZELLEN
4.5.1.8 ANALYSE DES EINFLUSSES VON GANODERMYCIN AUF DIE
KB-PHOSPHORYLIERUNG UND DEGRADATION
4.5.1.9 ANALYSE DES EINFLUSSES VON GANODERMYCIN AUF DIE IRF3-
VERMITTELTE CXCL10- EXPRESSION IN MONOMAC6- ZELLEN
4.5.1.10 EINFLUSS VON GANODERMYCIN AUF DIE DNABINDUNGSAKTIVITAET DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS IRF3 IN LPS- ODER POLY IC- INDUZIERTEN MONOMAC6-
ZELLEN
4.5.1.11 ANALYSE DES EINFLUSSES VON GANODERMYCIN AUF DIE PRODUKTION
PRO-INFLAMMATORISCHER CYTOKINE UND CHEMOKINE IM PROTEOME PROFILING
4.5.1.12 ANTIMIKROBIELLES WIRKUNGSSPEKTRUM VON GANODERMYCIN
4.5.2 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MJ 09102-1
4.5.2.1 WIRKUNG VON MJ 09102-1 AUF DIE CXCL10PROMOTOR ABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION
4.5.2.2 WIRKUNG VON MJ 09102-1 IN VERSCHIEDENEN ENTZUENDUNGSRELEVANTEN
REPORTERGENASSAYS
4.5.2.3 CYTOTOXIZITAETSTEST
4.5.2.4 EFFEKT VON MJ 09102-1 AUF DIE EXPRESSION PRO INFLAMMATORISCHER
GENE (QUANTITATIVE REAL TIME PCR)
4.5.2.5 EFFEKT VON MJ 09102-1 AUF DIE CXCL10- PRODUKTION UND
ZELLVITALITAET
4.5.2.6 ANALYSE DES EINFLUSSES VON MJ 09102-1 AUF DIE
SERIN-PHOSPHORYLIERUNG VON IRF3 IN MONOMAC6 ZELLEN
71
72
73
75
75
77
78
79
82
83
86
86
86
88
90
90
93
94
VIII
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS
4.5.2.7 UNTERSUCHUNG DES EFFEKTES VON MJ 09102-1 AUF DIE ST AT 1
-PHOSPHORYLIERUNG IN MONOMAC6 ZELLEN 94
4.5.3 BIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MJ 09102-2 95
4.5.3.1 WIRKUNG VON MJ 09102-2 AUF DIE CXCLIO-PROMOTORABHAENGIGE
REPORTERGENEXPRESSION 95
4.5.3.2 WIRKUNG VON MJ 09102-2 IN VERSCHIEDENEN ENTZUENDUNGSRELEVANTEN
REPORTERGENASSAYS 96
4.5.3.3 CYTOTOXIZITAETSTEST 99
4.5.3.4 EFFEKT VON MJ 09102-2 AUF DIE EXPRESSION PRO INFLAMMATORISCHER
GENE (QUANTITATIVE REAL TIME PCR) 99
4.5.3.5 ANALYSE DES EINFLUSSES VON MJ 09102-2 AUF DIE
SERIN-PHOSPHORYLIERUNG VON IRF3 IN MONOMAC6 ZELLEN 101
4.5.3.6 UNTERSUCHUNG DES EFFEKTES VON MJ 09102-2 AUF DIE
STAT1-PHOSPHORYLIERUNG IN MONOMAC6 ZELLEN 102
4.5.3.7 ANALYSE DES EINFLUSSES VON MJ 09102-2 AUF DIE
IKBPHOSPHORYLIERUNG UND DEGRADATION 103
4.5.3.8 EINFLUSS VON MJ 09102-2 AUF DIE DNABINDUNGSAKTIVITAET DES
TRANSKRIPTIONSFAKTORS IRF3 IN LPS- ODER POLY IC- INDUZIERTEN MONOMAC6-
ZELLEN 104
4.5.3.9 ANALYSE DES EINFLUSSES VON MJ 09102-2 AUF DIE PRODUKTION
PRO-INFLAMMATORISCHER CYTOKINE UND CHEMOKINE IM PROTEOME PROFILING 105
4.5.3.10 ANTIMIKROBIELLES WIRKUNGSSPEKTRUM VON MJ 09102-2 107
4.6 MODULATION DER EXPRESSION VON CXCL10 UND IMMUNO- RELEVANTER
MICRORNAS DURCH MACROCYCLISCHE LACTONE AUS PILZEN 108
4.6.1 EINFLUSS VON OXACYCLODODECINDION AUF DIE EXPRESSION
ENTZUENDUNGSRELEVANTER MRNAS UND MIRNAS 108
4.6.2 ANALYSE DER WIRKUNG VON OXACYCLODODECINDION AUF DIE MIRNA-
ZIELGEN- INTERAKTION 111
4.6.3 EINFLUSS VON S-CURVULARIN AUF DIE EXPRESSION ENTZUENDUNGSRELEVANTER
MIRNAS 119
4.6.4 ANALYSE DER WIRKUNG VON S-CURVULARIN AUF DIE
MIRNA-ZIELGEN-INTERAKTION 121
4.6.5 EINFLUSS VON OXACYCLODODECINDION UND S-CURVULARIN AUF DIE
EXPRESSION ENTZUENDUNGSRELEVANTER MIRNAS IN MONOZYTEN/MAKROPHAGEN 123
5. DISKUSSION 127
IX
IMAGE 7
INHALTSVERZEICHNIS
5.1 SCREENING NACH INHIBITOREN DER HUMANEN CXCL10- EXPRESSION 129
5.2 INHIBITOREN DER HUMANEN CXCL10- EXPRESSION AUS HOEHEREN PILZEN 131
5.2.1 GANODERMYCIN AUS GANODERMA APPLANATUM 09003 131
5.2.2 MJ 09102-1 UND MJ 09102-2 AUS CRINIPELLIS SP. 09102 133
5.3 UNTERSUCHUNGEN ZUM WIRKMECHANISMUS DER INHIBITOREN DER HUMANEN
CXCL10- EXPRESSION 134
5.3.1 GANODERMYCIN 134
5.3.2 MJ 09102-1 141
5.3.3 MJ 09102-2 146
5.4 MODULATION DER MIRNA- EXPRESSION DURCH MACROCYCLISCHE LACTONE IN IN
VITRO- MODELLEN DER RHEUMATOIDEN ARTHRITIS 148
5.5 THERAPEUTISCHES POTENTIAL NEUER ANTI INFLAMMATORISCHER WIRKSTOFFE
155
6. LITERATUR 158
7. ANHANG 178
8. ZUSAMMENFASSUNG 179
X
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