Identifizierung epigenetisch regulierter Gene beim Rhabdomyosarkom:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 RHABDOMYOSARKOM 1
1.2 EPIGENETISCHE GENREGULATION 4
1.3 DER B M P - SIGNALWEG 7
2 AUFGABENSTELLUNG 10
3 MATERIALIEN 11
3.1 ZELLLINIEN 11
3.2 ZELLMEDIEN 11
3.3 ANTIBIOTIKA 12
3.4 ENZYME 12
3.5 PLASMIDE 12
3.6 GROEUENSTANDARDS 13
3.7 PRIMER 13
3.8 REKOMBINANTE PROTEINE 17
3.9 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 17
3.10 PUFFER 18
3.11 KITS 18
3.12 VERBRAUCHSMATERIAL 18
3.13 GERAETE 19
4 METHODEN 21
4.1 EPIGENETISCHE METHODEN 2 1
4.1.1 IN VITRO DE NOVO METHYLIERUNG 21
4.1.2 BISULFITKONVERTIERUNG 21
4.1.3 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR 22
4.1.4 BISULFITSEQUENZIERUNG 23
4.2 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 2 5
4.2.1 KULTIVIEREN EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
4.2.2 PASSAGIEREN EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
4.2.3 KRYOKONSERVIERUNG EUKARYOTISCHER ZELLEN 25
4.2.4 BEHANDLUNG MIT 5-AZA-2 -DEOXYCYTIDIN 25
4.2.5 TRANSIENTE TRANSFEKTION 26
4.2.5.1 ELEKTROPORATION 26
II
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IMAGE 2
4.2.5.2 LIPOFEKTION 26
4.2.6 BEHANDLUNG MIT REKOMBINANTEM BMP2 27
4.2.7 PROLIFERATIONSASSAY 2 7
4.2.8 ANNEXIN-V-CALCEIN-ASSAY 28
4.3 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 2 9
4.3.1 DNA-ISOLATION AUS ADHAERENTEN ZELLEN UND GEWEBE 29
4.3.2 DNA-ISOLIERUNG AUS HUMANEM BLUT 29
4.3.3 RNA-ISOLATION AUS ADHAERENTEN ZELLEN UND GEWEBE 30
4.3.4 CDNA-SYNTHESE 31
4.3.5 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR 31
4.3.6 KLONIERUNG 3 2
4.3.6.1 TA-KLONIERUNG.; 32
4.3.6.2 KLONIERUNG IN EXPRESSIONSPLASMIDE 33
4.3.7 TRANSFORMATION VON LIGATIONSANSAETZEN IN E.COLI 33
4.3.8 BLAU-WEISS-SELEKTION 34
4.3.9 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA 34
4.3.10 RESTRIKTIONSVERDAU 3 5
4.3.10.1 ECORI-RESTRIKTIONSVERDAU 35
4.3.10.2 SMA I - RESTRIKTIONSVERDAU 36
4.3.10.3SMA I/HIND III - RESTRIKTIONSVERDAU 36
4.3.11 ORTSSPEZIFISCHE IN-VITRO MUTAGENESE 3 7
4.3.12 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 3 7
4.3.13 AGAROSE-GELEXTRAKTION 38
5 ERGEBNISSE . .....39
5.1 IDENTIFIZIERUNG EPIGENETISCH REGULIERTER GENE DES R M S 3 9
5.2 REAKTIVIERUNG VON BMP2 UND R A S S F 1 A DURCH DEMETHYLIERUNG 4 1
5.3 NACHWEIS VON B M P 2 UND DESSEN REZEPTOREN 4 3
5.4 BESTIMMUNG DES METHYLIERUNGSSTATUS VON B M P 2 44
5.4.1 METHYLIERUNGSANALYSE MITTELS BISULFITSEQUENZIERUNG 44
5.4.2 METHYLIERUNGSANALYSE MITTELS METHYLSPEZIFISCHER PCR 46
5.4.3 ANALYSE DER TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDESTELLEN IM BMP2-CPG-LSLAND
48
5.5 REAKTIVIERUNG VON B M P 2 4 9
5.5.1 HERSTELLUNG EINES BMP2 - EXPRESSIONSPLASMIDES 49
5.5.2 ETABLIERUNG EINER GEEIGNETEN TRANSFEKTIONSMETHODE FUER RMS 49
5.5.3 AUSWIRKUNGEN EINER BMP2 - REAKTIVIERUNG AUF DIE ZELLPROLIFERATION
5 2
5.5.4 AUSWIRKUNG EINER BMP2-REAKTIVIERUNG AUF DAS APOPTOSEVERHALTEN 54
III
IMAGE 3
5.5.5 AUSWIRKUNG EINER BMP2-REAKTIVIERUNG AUF DIE ZIELGENEXPRESSION 56
6 DISKUSSION 61
6.1 EXPRESSIONS- UND METHYLIERUNGSANALYSE IN RMS-ZELLLINIEN 6 1
6.2 REAKTIVIERUNG VON B M P 2 IN R M S ZELLLINIEN 6 6
6.3 MOEGLICHE AUSWIRKUNGEN DIESER ERGEBNISSE AUF EINE VERBESSERUNG DER
THERAPIE DES R M S UND ZUSAMMENHANG MIT ANDEREN SIGNALWEGEN 7 1
7 ZUSAMMENFASSUNG 74
8 LITERATURVERZEICHNIS 75
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 84
10 WISSENSCHAFTLICHE BEITRAEGE 87
10.1 TAGUNGSBEITRAEGE 8 7
10.2 PUBLIKATIONEN 8 7
11 DANKSAGUNG 88
IV
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