Nachweis leukämischer Stammzellen bei akuten kindlichen Leukämien mittels Hoechst 33342:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS VII!
1 EINLEITUNG 1
1.1 AKUTE LEUKAEMIEN 1
1.1.1 EPIDEMIOLOGIE DER LEUKAEMIEN IM KINDESALTER 2
1.1.2 PATHOGENESE UND AETIOLOGIE AKUTER LEUKAEMIEN 3
1.1.3 KLASSIFIKATION 3
1.1.4 MINIMALE RESTERKRANKUNG UND THERAPIE 4
1.2 HAEMATOPOESE 5
1.2.1 HAEMATOPOETISCHE STAMMZELLEN 6
1.2.2 CHARAKTERISIERUNG UND NACHWEIS HAEMATOPOETISCHER
STAMMZELLEN 8
1.2.3 NACHWEIS HAEMATOPOETISCHER STAMMZELLEN MITTELS
HOECHSTSIDEPOPULATION 10
1.3 LEUKAEMOGENESE 11
1.3.1 CHARAKTERISIERUNG LEUKAEMISCHER STAMMZELLEN 13
1.3.2 ROLLE LEUKAEMISCHER STAMMZELLEN BEI THERAPIE, RESISTENZ UND
REZIDIV 14
1.4 NK-ZELL-ZYTOTOXIZITAET 15
1.4.1 NK-ZELLEN 16
1.4.2 NACHWEIS DER NK-ZELL-VERMITTELTEN NATUERLICHEN ZYTOTOXIZITAET 17
1.5 STUDIENZIEL 18
2 PATIENTEN UND MATERIAL 19
2.1 PATIENTEN 19
2.1.1 EINSCHLUSSKRITERIEN 20
2.2 ALLGEMEINE GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALIEN 20
2.3 ALLGEMEINE CHEMIKALIEN 22
2.4 STAMMLOESUNGEN 23
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS V
2.5 VERWENDETE REAGENZIEN 24
2.5.1 STAMMZELLREAGENZIEN 24
2.5.2 FLUOROCHROM-KONJUGIERTE ANTIKOERPER 24
2.5.3 LEBEND/TOT-MARKER 29
2.5.4 BEADS 29
2.6 ZELLLINIE 30
2.7 EDV-SOFTWARE 30
3 METHODEN 31
3.1 VORBEREITUNG DER PATIENTENPROBEN 31
3.1.1 DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 31
3.1.2 KRYOKONSERVIERUNG VON ZELLEN 32
3.1.3 AUFTAUEN KRYOKONSERVIERTER PROBEN 32
3.2 HOECHST-FAERBUNG 33
3.2.1 HERSTELLUNG VON HOECHST 34
3.2.2 HOECHST-FAERBUNG 35
3.3 LEBEND/TOT-DIFFERENZIERUNG 36
3.3.1 PROPIDIUM LODID 37
3.3.2 ALEXAFLOUR 350 37
3.3.3 PACIFIC BLUE 38
3.4 PRINZIP DER DURCHFLUSSZYTOMETRIE 38
3.4.1 AUFBAU DES GERAETS UND MESSTECHNIK 38
3.4.2 KONFIGURATION DES LSR IL-DURCHFLUSSZYTOMETERS 40
3.4.3 KOMPENSATION AM LSR IL-DURCHFLUSSZYTOMETER 42
3.4.4 KALIBRIERUNG AM LSR IL-DURCHFLUSSZYTOMETER 43
3.4.5 GATING 44
3.5 UNTERSUCHUNG DER PATIENTENPROBEN IM RAHMEN DER
HOECHST-FAERBUNG 46
3.5.1 AUSWAHL DER ANTIKOERPER 46
3.5.2 VORGEHEN BEI DER AUSWERTUNG 47
3.6 KORRELATION MIT DEM KLINISCHEN VERLAUF 52
3.7 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 53
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS V I
3.7.1 VORBEREITUNG DER EFFEKTORZELLEN 53
3.7.2 ZIELZELLEN 54
3.7.3 DURCHFUEHRUNG DES ZYTOTOXIZITAETSASSAY 54
3.7.4 GATINGSTRATEGIE UND AUSWERTUNG 55
4 ERGEBNISSE 58
4.1 EINLEITUNG 58
4.1.1 ZIEL DER STUDIE 58
4.1.2 STUDIENPOPULATION 58
4.2 ERFASSUNG DER SIDEPOPULATION MITTELS HOECHST 33342 60
4.2.1 FAERBEPROTOKOLL 60
4.2.2 KONTROLLFAERBUNG MIT VERAPAMIL 62
4.2.3 EINFLUSS DER MESSBEDINGUNGEN AUF DIE SP 63
4.2.4 EINFLUSS DES BEHANDLUNGSTAGES AUF DIE SP 64
4.3 LEBEND/TOT-DIFFERENZIERUNG 64
4.4 ALL-PROBEN 65
4.4.1 MESSERGEBNISSE 65
4.4.2 VERGLEICH MIT DEN STAMMZELLMARKERN CD34/C038 66
4.4.3 KORRELATION MIT DEM KLINISCHEN VERLAUF 68
4.4.4 VERHALTEN DER SP UNTER BEHANDLUNG 70
4.4.5 ZUSAMMENFASSUNG 72
4.5 AML-PROBEN 73
4.5.1 MESSERGEBNISSE 73
4.5.2 VERGLEICH MIT DEN STAMMZELLMARKERN CD34 UND CD38 73
4.6 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 1 . 74
4.6.1 AKTIVIERUNG DER NK-ZELLEN 74
4.6.2 AKTIVIERUNG DER T-ZELLEN 78
4.6.3 EFFEKT DER ZYTOTOXIZITAET 79
4.6.4 ZUSAMMENFASSUNG 79
5 DISKUSSION 80
5.1 EINLEITUNG 80
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS V I I
5.2 HOECHST-FAERBUNG 84
5.2.1 METHODISCHE ASPEKTE 84
5.3 ALL-PROBEN 85
5.3.1 MESSERGEBNISSE UND VERGLEICH DER SP MIT DEN
STAMMZELLMARKERN CD34/CD38 85
5.3.2 KORRELATION MIT DEM KLINISCHEN VERLAUF 86
5.3.3 VERHALTEN DER SP UNTER BEHANDLUNG 88
5.4 AML-PROBEN 89
5.4.1 MESSERGEBNISSE UND VERGLEICH DER SP MIT DEN
STAMMZELLMARKERN CD34/CD38 89
5.5 ZYTOTOXIZITAETSASSAY 90
5.5.1 AKTIVIERUNG DER NK-ZELLEN 90
5.5.2 EINFLUSS VON IL-2 AUF DIE AKTIVIERUNG DER NK-ZELLEN 92
5.5.3 AKTIVIERUNG DER T-ZELLEN 92
5.5.4 EFFEKT DER ZYTOTOXIZITAET 93
5.6 AUSBLICK 93
6 ZUSAMMENFASSUNG 95
7 LITERATURVERZEICHNIS ; - 9 7
8 ANHANG 103
8.1 EINGESCHLOSSENE PATIENTEN UND MESSERGEBNISSE 103
8.2 AUSWERTEBLATT DER HOECHST-FAERBUNG 106
8.3 AUSWERTEBLATT DES ZYTOTOXIZITAETSASSAY 108
8.4 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 110
8.5 TABELLENVERZEICHNIS 111
9 DANKSAGUNG 113
10 LEBENSLAUF 114
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