Expressionsanalyse, zelluläre Lokalisierung und proteinbiochemische Charakterisierung des porzinen CLCA-Homologen pCLCA4a: Unterschiede zu seinen Orthologen bei Mensch und Maus?
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III
INHALT
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS .VI
1 EINLEITUNG 1
2 FORSCHUNGSSTAND 4
2.1 DIE CLCA ( CHLORIDE CHANNEL REGULATORS, CALCIUM-ACTIVATED) - FAMILIE
4
2.1.1 PROTEINSTRUKTUR UND PROTEINPROZESSIERUNG 5
2.1.2 EXPRESSIONSVIELFALT DER CLCA-PROTEINE 7
2.1.3 FUNKTIONSDIVERSITAET DER CLCA-PROTEINE 10
2.1.3.1 DIE KALZIUM-AKTIVIERTE CHLORIDLEITFAEHIGKEIT DER CLCA-PROTEINE 10
2.1.3.2 EIGENSTAENDIGE CHLORIDKANAELE ODER MODULATOREN VON CHLORIDKANAELEN?
11
2.1.3.3 FUNKTION ALS ADRESSINE 11
2.1.3.4 FUNKTION ALS APOPTOSEREGULATOREN 12
2.1.4 BIOMEDIZINISCHE RELEVANZ DER CLCA-PROTEINE 13
2.1.4.1 ROLLE DER CLCA BEI DER ZYSTISCHEN FIBROSE 14
2.1.4.2 ROLLE DER CLCA BEIM ASTHMA 17
2.1.4.3 ROLLE DER CLCA BEI DER RECURRENT AIRWAY OBSTRUCTION (RAO) DES
PFERDES ..18
2.1.5 DIE PORZINEN CLCA-HOMOLOGEN 19
2.1.5.1 CHARAKTERISIERUNG DER PORZINEN C/.C/ -GENOMSTRUKTUR 19
2.1.5.2 PCLCAL 21
2.2 BEDEUTUNG VON TIERMODELLEN IN DER TRANSLATIONALEN FORSCHUNG 22
2.2.1 BISLANG VERWENDETE TIERMODELLE IN DER ZYSTISCHE FIBROSE-FORSCHUNG
23
2.2.2 DAS SCHWEINE-MODELL IN DER ZYSTISCHE FIBROSE-FORSCHUNG 27
3 MATERIAL UND METHODEN 31
3.1 ERSTELLUNG EINES PHYLOGENETISCHEN BAUMES 31
3.2 IN S/7/ CO-ANALYSEN ZUR VORHERSAGE DER SIGNALPEPTIDSEQUENZ,
TRANSMEMBRAN
DOMAENEN UND GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN 31
3.3 UNTERSUCHUNGSMATERIAL UND PROBENGEWINNUNG 32
3.4 GENERIERUNG SPEZIFISCHER ANTIKOERPER GEGEN PCLCA4A 33
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IMAGE 2
IV
INHALT
3.5 PROBENAUFBEREITUNG FUER NACHFOLGENDE UNTERSUCHUNGEN 34
3.5.1 PARAFFINEINBETTUNG UND HERSTELLUNG VON GEWEBESCHNITTEN 34
3.5.2 ANFERTIGUNG VON KRYOSTATSCHNITTEN 35
3.5.3 AUFBEREITUNG DER PROBEN FUER MOLEKULARBIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 35
3.5.3.1 ALLGEMEINE MASSNAHMEN ZUR VERMEIDUNG VON KONTAMINATIONEN 35
3.5.3.2 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA 35
3.5.3.3 REVERSE TRANSKRIPTION ZUR GEWINNUNG VON CDNA 36
3.5.4 HERSTELLUNG VON ORGANLYSATEN UND ERMITTLUNG DER
PROTEINKONZENTRATIONEN 37
3.6 POLYMERASE-KETTENREAKTION ZUM ORGANSPEZIFISCHEN NACHWEIS VON PCLCA4A
AUF
RNA-EBENE UND ZUR AMPLIFIZIERUNG DES OFFENEN LESERAHMENS VON PCLCA4A 38
3.7 KLONIERUNG DES OFFENEN LESERAHMENS VON PCLCA4A IN DEN VEKTOR
PCDNA3.1 (+) 41
3.7.1 DIFFERENZIERUNG ZU PCLCA4B 47
3.8 GEWINNUNG VON SPEZIFISCHEM PROTEIN NACH HETEROLOGER TRANSFEKTION VON
HEK
293-ZELLEN MIT DEM PCLCA4A-PLASMID 48
3.8.1 ZELLLYSE UND GEWINNUNG DES PROTEINS MITTELS IMMUNOPRAEZIPITATION 50
3.8.2 GEWINNUNG DES PROTEINS MITTELS ETHANOLPRAEZIPITATION AUS DEM
ZELLKULTURUEBERSTAND SOWIE ZELLLYSE 51
3.9 NATRIUMDODECYLSULFAT- POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 52
3.10 WESTERNBLOTANALYSE 53
3.11 BESTIMMUNG DES GLYKOSYLIERUNGSMUSTERS 55
3.12 LASER CAPTURE MICRODISSECTION ZUR PROTEOMANALYSE 55
3.13 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS DES PCLCA4A-PROTEINS 57
3.14 ALLGEMEIN VERWENDETE PUFFER, LOESUNGEN UND CHEMIKALIEN 59
4 ERGEBNISSE 62
4.1 PHYLOGENETISCHE EINORDNUNG 62
4.2 DIE PCLCA4A-PROTEINSTRUKTUR NACH IN SILICO- ANALYSEN 63
4.2.1 POTENZIELLE SIGNALSEQUENZEN 63
4.2.2 POTENZIELLE TRANSMEMBRANDOMAENEN 64
IMAGE 3
INHALT
V
4.2.3 POTENZIELLE ASPARAGIN-GLYKOSYLIERUNGSSTELLEN UND DIE MUTMASSLICHE
SPALT
STELLE 66
4.3 DAS GEWEBLICHE MRNA-EXPRESSIONSMUSTER VON PCLCA4A 67
4.4 DIE SEQUENZ DES OFFENEN LESERAHMENS VON PCLCA4A 70
4.5 PROTEINBIOCHEMISCHE CHARAKTERISTIKA VON PCLCA4A 70
4.5.1 KRITERIEN DER ANTIKOERPERGENERIERUNG 70
4.5.2 DETEKTION DES AMINO-TERMINALEN UND DES CARBOXY-TERMINALEN
SPALTPRODUKTS
VON PCLCA4A IN ZELLLYSAT UND ZELLKULTURUEBERSTAND SOWIE NACHWEIS DER
POSTTRANSLATIONALEN SPALTUNG 71
4.6 DIE GEWEBLICHE VERTEILUNG VON PCLCA4A IN DEN ORGANEN DES SCHWEINS 73
4.7 DAS ASPARAGIN-GLYKOSYLIERUNGSMUSTER VON PCLCA4A 77
4.8 ZELLULAERES EXPRESSIONSMUSTER DES PCLCA4A-PROTEINS 80
5 DISKUSSION 85
6 ZUSAMMENFASSUNG 98
7 SUMMARY 100
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 102
9 TABELLENVERZEICHNIS 104
10 LITERATURVERZEICHNIS 105
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 123
DANKSAGUNG 124
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 125
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| spelling | Grötzsch, Tanja Verfasser (DE-588)1032811463 aut Expressionsanalyse, zelluläre Lokalisierung und proteinbiochemische Charakterisierung des porzinen CLCA-Homologen pCLCA4a Unterschiede zu seinen Orthologen bei Mensch und Maus? vorgelegt von Tanja Grötzsch Expression pattern analysis, cellular localization and biochemical characterization of the porcine homolog CLCA4a Berlin Mensch & Buch 2013 VIII, 125 S. graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Nebentitel: Expression pattern analysis, cellular localization and biochemical characterization of the porcine homolog CLCA4a Berlin, Freie Univ., Diss., 2013 cystic fibrosis cabt animal models cabt pigs cabt mice cabt chloride cabt ion transport cabt messenger RNA cabt gene expression cabt protein cabt polymerase chain reaction cabt antibody testing cabt immunohistochemistry cabt immunoblotting cabt immunoprecipitation tests cabt Schwein (DE-588)4053848-5 gnd rswk-swf Chloridkanal (DE-588)4291189-8 gnd rswk-swf Tiermodell (DE-588)4140660-6 gnd rswk-swf Mukoviszidose (DE-588)4040669-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Mukoviszidose (DE-588)4040669-6 s Chloridkanal (DE-588)4291189-8 s Tiermodell (DE-588)4140660-6 s Schwein (DE-588)4053848-5 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000093797-1 http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000093797 kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=025886835&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
| spellingShingle | Grötzsch, Tanja Expressionsanalyse, zelluläre Lokalisierung und proteinbiochemische Charakterisierung des porzinen CLCA-Homologen pCLCA4a Unterschiede zu seinen Orthologen bei Mensch und Maus? cystic fibrosis cabt animal models cabt pigs cabt mice cabt chloride cabt ion transport cabt messenger RNA cabt gene expression cabt protein cabt polymerase chain reaction cabt antibody testing cabt immunohistochemistry cabt immunoblotting cabt immunoprecipitation tests cabt Schwein (DE-588)4053848-5 gnd Chloridkanal (DE-588)4291189-8 gnd Tiermodell (DE-588)4140660-6 gnd Mukoviszidose (DE-588)4040669-6 gnd |
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