Lokalisierung und Charakterisierung der AAA+-Proteine AFG1L2 und AFG1L1 aus Arabidopsis thaliana:
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EINLEITUNG
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 DAS KALZIUM-SIGNALNETZWERK 1
1.2 AAA + -PROTEINE 3
1.3 AFGL-LIKE PROTEINE IN ARABIDOPSIS 5
2. MATERIAL UND METHODEN 7
2.1 CHEMIKALIEN, VERBRAUCHSMATERIAL UND SAATGUT 7
2.2 GROESSENMARKER UND SAEULENMATERIAL 7
2.3 ENZYME UND KITS 8
2.4 BAKTERIENSTAEMME 8
2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 9
2.5.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) UND KLONIERUNGSSTRATEGIE 9
2.5.2 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS ARABIDOPSI THALIANA 10
2.5.3 ISOLIERUNG VON RNA AUS ARABIDOPSIS THALIANA 10
2.5.4 CDNA-SYNTHESE UND QRT-PCR 11
2.6 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 12
2.6.1 HETEROLOGE EXPRESSION VON REKOMBINANTEN PROTEIN 12
2.6.2 PFLANZENANZUCHT 12
2.6.3 TRANSIENTE PROTOPLASTENTRANSFORMATION VON BRASSICA RAPA 12
2.6.4 TRANSFORMATION VON NICOTIANA BENTHAMIANA UND PROTOPLASTENISOLATION
13
2.6.5 STABILE TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA UND GUS-FAERBUNG 13
2.6.6 GENERIERUNG DER AFGL1 7/A/G7/2-MUTANTE DURCH KREUZUNG 14
2.6.7 HEFE ANZUCHT UND SPLIT-UBIQUITIN-ASSAY 14
2.7 BIOCHEMISCHE METHODEN 15
2.7.1 CHROMATOGRAPHISCHE METHODEN 15
2.7.1.1 AUFREINIGUNG AN NI-NTA 15
2.7.1.2 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 15
2.7.1.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN CALMODULIN-AGAROSE 16
2.7.1.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN GFP-TRAP ODER IGG-SEPHAROSEL6
2.7.2 BN-PAGE 17
2.7.3 QUERVERNETZUNGS-VERSUCHE 17
2.7.4 ATPASE-AKTIVITAETSNACHWEIS 18
2.7.4.1 DUENNSCHICHTCHROMATOGRAHPIE 18
I I I
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IMAGE 2
EINLEITUNG
2.7.4.2 LUZIFERASE-ASSAY 18
2.8 COMPUTERANALYSEN 18
2.9 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 19
3. ERGEBNISSE 20
3.1 VERGLEICHENDE ANALYSE VON PROTEINDOMAENEN IN AFG1L2 UND AFG1L120
3.2 LOKALISIERUNGSSTUDIEN 23
3.2.1 TRANSIENTE TRANSFORMATION VON GFP-FUSIONSPROTEINEN 23
3.2.2 ANALYSEN ZUR LOKALISATION MITTELS SELF-ASSEMBLING GFP 25
3.2.3 IDENTIFIZIERUNG DER TRANSITSEQUENZEN VON AFG1L2 UND AFG1L129
3.3 EXPRESSION VON LOESLICHEM AFG1L2 UND AFG1L1 31
3.4 INTERAKTIONSSTUDIEN MIT CALMODULIN 33
3.4.1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE AN CALMODULIN-AGAROSE 34
3.4.2 QUERVERNETZUNGSVERSUCHE 36
3.4.2.1 KALZIUMABHAENGIGE QUERVERNETZUNG VON AFG1L2 UND CALMODULIN 36
3.4.2.2 EINFLUSS VON ATP AUF DIE QUERVERNETZUNG VON AFG1L2 UND
CALMODULIN 37
3.4.3 VERSUCHE ZUR IN V/VO-INTERAKTION MITTELS SPLIT-UBIQUITIN 40
3.5 OLIGOMERISIERUNGS- UND AKTIVITAETSSTUDIEN 40
3.5.1 BN-PAGE 41
3.5.2 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 42
3.5.2.1 OLIGOMERISIERUNG UND AKTIVITAET VON AFG1L2 42
3.5.2.2 EINFLUSS VON 6-AMINOHEXANSAEURE AUF DIE OLIGOMERISIERUNG VON
AFG1L2 45
3.6 INPLANTA UNTERSUCHUNGEN ZUR FUNKTION VON AFG1L2 UND AFG1LI 49
3.6.1 UNTERSUCHUNG VON T-DNA-INSERTIONSLINIEN VON AFG1L2 UND AFG1L1 50
3.6.2 GENERIERUNG EINER Q/^//7/O/^7/2-DOPPEL-MUTANTE 52
3.6.3 EXPRESSIONSANALYSE VON AFG1L2 UND AFG 1 L I 55
3.6.3.1 ANALYSE DER AFG1L1 EXPRESSIONSDATEN DURCH GENEVESTIGATOR55
3.6.3.2 GUS-REPORTERGEN-PFLANZEN 56
3.6.3.3 QRT-PCR 58
4. DISKUSSION 64
5. LITERATUR 71
6. ZUSAMMENFASSUNG 78
I V
IMAGE 3
EINLEITUNG
7. ABSTRACT 79
8. DANKSAGUNG 80
9. ANHANG 81
9.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 81
9.2 VEKTOREN, PRIMER, ERZEUGTE KONSTRUKTE 82
V
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