Aufklärung der Pathogenese der mentalen Retardierung beim 5q14.3q15 Mikrodeletionssyndrom:
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2013
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
1.1 MENTALE RETARDIERUNG ........................ ....................
............. 1
1.2 GENETISCHE URSACHEN DER MENTALEN RETARDIERUNG .................... -
2
1J STRATEGIEN UND MOLEKULARE METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG VON
KRANKHEITS
VERURSACHENDEN (MR-)GENEN ................. ............... 5
1.4 MIKRODELETIONEN IN DER CHROMOSOMALEN REGION 5QL4.3QL5 10
15 ZIELSETZUNG DER ARBEIT .........................
..................... ...................* 11
2. MATERIAL UND
METHODEN 13
2.1 PATIENTEN UND KONTROLLGRUPPEN... .....................
............... ..... 13
2.2 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.................... .................
............... 13
2.2.1 AUTOMATISIERTE DNA-ISOLATION AUS HUMANEM BLUT 13
2.2.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 13
2.2.3 RNA-ISOLATION 14
23 GELELEKTROPHORESE ...................... - ............. 14
2.4 AUFREINIGUNG VON NUKLEINSSUREN.............. .................
............... 14
2.4.1 DNA-AUFREINIGUNG 14
2.4.2 RNA-AUFREINIGUNG DURCH DNASEL-VERDAU 14
2.5 QUANTIFIZIERUNG UND QUALITAETSKONTROLLE VON NUKLEINSAEUREN ....... 15
2.6 AMPLIFIKATION GENOMISCHER DNA MITTELS WHOLE GENOME AMPLIFICATION 15
2.7 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR)........ 16
2.7.1 PRIMERDESIGN 16
2.7.2 DURCHFUEHRUNG DER POLYMERASE-KETTENREAKTION 16
2.7.3 ^MPWE-AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE 17
2.7.4 ENZYMATISCHE AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE 17
2.8 KLONIERUNG ...................... ....................
............... ...... 18
2.8.1 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN MITTELS TOPO-TA-KLONIERUNG 18
2.8.2 SPALTUNG VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN 18
2.8.3 EXTRAKTION VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 18
2.8.4 ANNEALING VON SYNTHETISIERTEN OLIGONUKLEOTIDEN 19
2.8.5 LIGATION 19
2.8.6 TRANSFOMATION 19
2.8.7 IDENTIFIZIERUNG POSITIVER KLONE 20
2.8.8 GERICHTETE MUTAGENESE 20
2.8.9 EXPRESSIONS- UND REPORTERKONSTRUKTE 21
2.9 SEQUENZIERUNG VON DNA ...............................
................... .................. 22
2.9.1 SEQUENZIEIREAKTION 22
2.9.2 AUFREINIGUNG DER SEQUENZIERREAKTION 22
2.9.3 SEQUENZANALYSE UND AUSWERTUNG 22
2.10 REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)............. 23
I
HTTP://D-NB.INFO/1035037211
INHALTSVERZEICHNIS
2.11 QUANTITATIVE *REAL-TIME PCR (QPCR)
......................................... 23
2.11.1 QPCR MIT TAQMAN-SONDEN 24
2.11.2 QPCR MIT SYBR GREEN-SONDEN 26
2.12 MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG UND EXPRESSIONSANALYSEN MITTELS
MIKROARRAY...27
2.12.1 GENOMWEITE MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG MITTELS MIKROARRAY 27
2.12.2 GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSEN MITTELS MIKROARRAY 28
2.13 MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT
PROBE AMPUFLCATION (MLPA)... 30
2.13.1 DESIGN DER MLPA-SONDEN 30
2.13.2 DURCHFUEHRUNG DER MLPA 31
2.13.3 AUSWERTUNG DER MLPA 31
2.14 FLUORESZENZ-IFINRIFTI-HYBRIDISIERUNG
(FISH)...................................................*.... 31
2.14.1 HERSTELLUNG VON FISH-SONDEN 31
2.14.2 DURCHFUEHRUNG DER FISH 33
2.14.3 AUSWEITUNG DER FISH 34
2.15 ZELLKULTUR.........................................
...................................................34
2.15.1 KULTURVON EUKARYOTISCHEN ZELLLINIEN 34
2.15.2 PASSAGIEREN VON ZELLEN 34
2.15.3 HERSTELLUNG UND REVITALISIERUNG VON GEFRIERSTOCKS 34
2.15.4 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 35
2.16
LUZIFERASE-ASSAY.......................................................
35
2.17 CHROMATIN-IMMUNOPRAEZIPITATION (CHIP)
.......................................... .......37
2.18 IN SILICO
MUTATIONSMODELLIERUNG............................................ 38
2.19 MATERIALIEN UND REAGENZIEN
........................................................................
38
2.19.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 38
2.19.2 ENZYME, STANDARDS UND CHEMIKALIEN 39
2.19.3 LOESUNGEN 41
2.19.4 OLIGONUKLEOTIDE 44
2.19.5 MPLA-SONDEN 44
2.19.6 BAC-KLONE 44
2.19.7 TAQMAN-SONDEN 44
2.19.8 ANTIKOERPER 45
2.19.9 VEKTOREN 45
2.19.10 KITS 45
2.19.11 ARRAYS 46
2.19.12 GERATE 46
2.19.13 DATENBANKEN UND SOFTWARE 47
3. ERGEBNISSE 49
3.1 MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG VON MR-PATIENTEN.....
....................... 49
3.1.1 ANALYSE MITTELS AJFFYMETRIX SNP ARRAY 6.0 49
3.1.2 FILTERUNG DER DATEN UND INITIALE PATHOGENITAETSANALYSE DER CNVS 50
3.1.3 METHODENVALIDIERUNG 50
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.4 SEGREGATIONSANALYSE 51
3.1.5 ABSCHLIESSENDE PATHOGENITAETSANALYSE DER 56 SELTENEN CNVS 51
3.2 IDENTIFIZIERUNG VON A/EK?C-DEFEKTEN ALS URSACHE MENTALER
RETARDIERUNG....... 54
3.2.1 IDENTIFIZIERUNG VON DELETIONEN IN DER CHROMOSOMALEN REGION
5QI4.3QL
5 54
3.2.1.1 MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG UND SEGREGATIONSANALYSE 54
3.2.1.2 REKRUTIERUNG VON DREI WEITEREN PATIENTEN MIT DELETIONEN IN DER
CHROMOSOMALEN
REGION 5QL4.3QL5 56
3.2.1.3 MLPA-ANALYSE DES
MEF2C-
LOKUS 57
3.2.2 EXPRESSIONSMUSTER VON MEF2C IN HUMANEN GEWEBEN 57
3.2.3 SEQUENZIER-SCREENING VON MEF2C 58
3.2.3.1 INITIALES SCREENING VON 362 MR-PATIENTEN 59
3.2.3.2 GEZIELTES SCREENING IN SELEKTIERTEN PATIENTENGRUPPEN 60
3.2.4 ANALYSE DER A/F2C-EXPRESSIONSLEVEL IN PATIENTENBLUT 61
3.2.5 CHARAKTERISIERUNG DER MISSENSE-MUTATIONEN IM MEF2C-GEN 62
3.2.5.1
IN SILICO
ANALYSE MITTELS HOMOLOGIEMODELLIERUNG 62
3.2.5.2 FUNKTIONELLE REPORTERASSAYS 63
3 J ANALYSE WEITERER KANDIDATENGENE DER CHROMOSOMALEN REGION 5QL 4 JQL
5. 66
3.3.1 EXPRESSIONSANALYSE VON MEF2C IM BLUT WEITERER REKRUTIERTER
PATIENTEN MIT
DE NOVO
DELETIONEN IN DER CHROMOSOMALEN REGION 5QL4.3QL5 66
3.3.2 EXPRESSIONSANALYSEN WEITERER REGIONALER KANDIDATENGENE 67
3.3.2.1 EXPRESSIONSANALYSE DER KANDIDATENGENE IN GEHINIGEWEBE 67
3.3.2.2 EXPRESSIONSANALYSE DER KANDIDATENGENE IN PATIENTENBLUT 68
3.3.3 SEQUENZIER-SCREENING VON L YSMD3 71
3.3.4 IDENTIFIZIERUNG EINER FAMILIE MIT SEGREGIERENDER, PROXIMALER
DELETION IM
CHROMOSOMALEN BEREICH 5QL4.3 71
3.4 KLINISCHER PHAENOTYP DER PATIENTEN MIT MF2C-MUTATIONEN UND
DELETIONEN
IN DER REGION SQL4JQL5....... ............... ............. .73
35 ANALYSE DER MOLEKULAREN PATHOGENESE DER
MFFZC-HAPLOINSUFFIZIENZ......... 81
3.5.1 EXPRESSIONSANALYSEN VON MECP2, CDKL5 UND TCF4 IM BLUT DER MEF2C-
DEFIZIENTEN PATIENTEN 81
3.5.2 FUNKTIONELLE REPORTERASSAYS AN CDKL5- UND
MECP2-PROMOTORKONSTRUKTEN... 82
3.5.3 SEQUENZIER-SCREENING VON BDNF 84
3.5.4 GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSEN AN MEF2C- UND MTCPI-PUNKTMUTATIONS-
PATIENTEN 84
3.5.4.1 DIFFERENTIELL EXPRIMIERTE GENE IN DEN PATIENTENGRUPPEN 85
3.5.4.2 IDENTIFIZIERUNG DER IN BEIDEN PATIENTENGRUPPEN GEMEINSAM
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTEN GENE 87
3.5.4.3 UNABHAENGIGE VALIDIERUNG DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER GENE 90
3.5.4.4 SEQUENZIER-SCREENING DES
CDKI9-GENS
90
3.5.5 CHROMALIN-IMMUNOPRAEZIPITATION (CHIP) 91
4. DISKUSSION 93
4.1 MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG VON MR-PATIENTEN ZUR IDENTIFIZIERUNG
PATHOGENER CNV
S................. ............... ............... ...............
........ 93
4.2 IDENTIFIZIERUNG VON MEF2C-DETEKTTN ALS URSACHE DES
MIKRODELETIONSSYN-
DROMS SQL4JQLS UND ALS HUEUFIGE URSACHE SCHWERER MENTALER RETARDIERUNG
...96
III
INHALTSVERZEICHNIS
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG DES KRITISCHEN INTERVALLS IM CHROMOSOMALEN BEREICH
5QL4.3QL5 96
4.2.2 KANDIDATENGEN MEF2C 97
4.2.3 EXPRESSION DES KANDIDATENGENS MEF2C IM BLUT DER DELETIONSPATIENTEN
100
4.2.4 IDENTIFIZIERUNG VON MT/^C-PUNKTMUTALIONEN ALS HAEUFIGE URSACHE
SCHWERER
MRBZW. DES MDS 5QL4.3QL5-PHAENOTYPS 100
4.2.5 CHARAKTERISIERUNG DER PUNKTMUTATIONEN 101
4.2.6 SKIZZIERUNG UND BESTAETIGUNG DES PHAENOTYPS BEI MEF2C-DEFEKTEN MIT
ABSCHLIESSENDER DISKUSSION 102
4J ANALYSE WEITERER KANDIDATENGENE DER CHROMOSOMALEN REGION 5QL4JQLS:
IS MEF2C
THE WHOLE STOERY ?............ 104
4.3.1 ANALYSE WEITERER REGIONALER KANDIDATENGENE 105
4.3.2 ABSCHLIESSENDE DISKUSSION DER MIKRODELETIONSREGION 5QL4.3QL5 106
4.4 MOLEKULARE PATHOGENESE DER AFF2C-HAPLOINSUFFIZIENZ: ANALYSE DES ZU
GRUNDE LIEGENDEN NETZWERKS ...........................................
109
4.4.1 MEF2C REGULIERT DIE EXPRESSION VON MECP2 UND CDKL5 109
4.4.1.1 PHAENOTYPISCHE UEBERLAPPUNG MIT ATYPISCHEM RETT-SYNDROM UND MIT
PITT-
HOPKINS-SYNDROM VERBINDET
MEF2C
MIT
MECP2, CDKL5
UND
TCF4
109
4.4.1.2 ANALYSE DER MOLEKULAREN VERBINDUNG VON MEF2C MIT MECP2, CDK.L5
UND
TCF4: MEF2C
REGULIERT
DIE TRANSKRIPTION DES
MECP2-
UND
CDKL5-CENS
111
4.4.2 MUTATIONEN IM BDNF-GEN ALS URSACHE SCHWERER MENTALER RETARDIERUNG
? 113
4.4.3 MEF2C- UND MECP2-ABHAENGIGE GLOBALE GENREGULATION: IDENTIFIZIERUNG
GENOMWEIT BEEINFLUSSTER GENE 114
4.4.3.1 VERNETZUNG VON MEF2C UND MECP2 MIT WEITEREN MR-GENEN: MECP2
REPRIMIERT DIE TRANSKRIPTION DES
TCF4-GENS
117
4.4.3.2 MEF2C UND MECP2 BEEINFLUSSEN EINE GEMEINSAME GRUPPE VON GENEN
118
4.4.4 ZUSAMMENFASSENDE DISKUSSION DER ERGEBNISSE ZUR PATHOGENESE DER
MEF2C-
HAPLOINSUFFIZIENZ 119
5. ZUSAMMENFASSUNG 121
6. SUMMARY 123
7. LITERATURVERZEICHNIS 125
8. ANHANG 135
8.1 VERZEICHNISSE (ABKUERZUNGEN, ABBILDUNGEN,
TABELLEN)...................................... 135
8J OLIGONUKLEOTIDE UND MLPA-SONDEN
......................................................... 143
8 J MOLEKULARE KARYOTYPISIERUNG: LISTE DER DETEKTIERTEN 56 SELTENEN CNVS
148
8.4 EXPRESSIONSANALYSE DER KANDIDATENGENE DER CHROMOSOMALEN REGION
5QL4.3QL5 150
8.5 GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSE: LISTE DER IM PATIENTENBLUT
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTEN AUTOSOMALEN GENE 153
8.6 DANKSAGUNG.... .................................. 168
8.7 LEBENSLAUF................................
................................................................169
8.8 PUBLIKATIONEN.......................... 170
IV
|
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