Mutationsanalyse von in den B-Zell-Rezeptor-Signalweg involvierten Genen in primären Lymphomen des Zentralnervensystems:
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2012
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INHALTVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PRIMAERE LYMPHOME DES ZENTRALNERVENSYSTEMS (PCNSL) 1
1.2 DIE ROLLE DES BCR-PATHWAY IN DER B-ZELLENTWICKLUNG 3
1.2.1 BCR-STRUKTUR 3
1.2.2 CD79A (LG-A) & CD79B (IG-SS) 5
1.2.3 BCR-SIGNALTRANSDUKTION 6
1.2.4 TONISCHE UND ANTIGEN-ABHAENGIGE INITIATION
DER BCR- SIGNALTRANSDUKTION 8
1.3 NEGATIVE REGULATION DER BCR-TRANSDUKTION 9
1.3.1 BLNK 9
1.3.2 C-CBL 10
1.3.3 SHP1&SHP2 11
1.3.4 PTEN, SHIP & DOK3 11
1.4 ZIEL DER ARBEIT UND AUSWAHLKRITERIEN DER ZIELGENE 12
2 METHODEN UND MATERIALIEN 14
2.1 METHODEN 14
2.1.1 DNA-EXTRAKTION AUS ZELLPELLET 14
2.1.2 QUALITAETS-UND KONZENTRATIONSBESTIMMUNG DER DNA 14
2.1.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 15
2.1.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 15
2.1.5 STRATEGIE DER 2-RUNDEN SEMI-NESTED PCR 16
2.1.6 PRIMERAUSWAHL 17
2.1.7 ETABLIERUNG DER REAKTIONSBEDINGUNGEN 17
2.1.8 AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE NACH EXONUCLEASE I SHRIMP-ALKALISCHE
PHOSPHATASE-BEHANDLUNG (EXOSAP) 18
2.1.9 AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE UEBER AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 19
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.1.10 SEQUENZIERUNG NACH SANGER (KETTENABBRUCH-REAKTION) 19
2.1.11 SEQUENZANALYSE 20
2.1.12 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS HUMANEN ZELLINIEN 20
2.1.13 CDNA-SYNTHESE 21
2.1.14 AMPLIFIKATION CODIERENDER BEREICHE VON
CD79B, BLNK, INPP5D (SHIP) UND C-CBL MITTELS EINSATZ
PHUSION HOT START II (HIGH- FIDELITY DNA POLYMERASE) 22
2.1.15 AUFREINIGUNG DER PCR-PRODUKTE MITTELS AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
23
2.1.16 TA-KLONIERUNG IM PLENTI-6.3 EXPRESSIONSVEKTOR 24
2.1.17 KLONIERUNG IN PLENTI6.3-V5 PER RESTRIKTION UND ANSCHLIESSENDE
LIGATION (T4 LIGASE) VON INSERT UND VEKTOR 24
2.1.18 SITE DIRECTED MUTAGENESIS (MODIFIZIERT NACH SHENOY ET AL.) 26
2.1.19 PRAEPARATION VON TRANSFORMATIONSKOMPETENTEN E.CO//-ZELLEN 26
2.1.20 TRANSFORMATION VON .CO//-ZELLEN 27
2.1.21 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI (MINI-PRAEP) 27
2.1.22 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E.COLI (MAXI-PRAEP) 27
2.2 MATERIALIEN 28
2.2.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN UND DEREN ZUSAMMENSETZUNG 28
2.2.2 BIOINFORMATISCHE HILFSMITTEL, VERWENDETE SOFTWARE, ARBEITSGERAETE
30
2.2.3 REFERENZSEQUENZEN 31
2.2.4 DIE PCNSL- UND SPINALE DLBCL-DNA KOLLEKTION
UND DIE REFERENZZELLINIEN 33
2.2.5 VERWENDETE PRIMER UND ETABLIERTE REAKTIONSBEDINGUNGEN 35
2.2.5.1 ERSTRUNDEN PRIMER UND REAKTIONSBEDINGUNGEN 35
2.2.5.2 ZWEITRUNDEN PRIMER UND REAKTIONSBEDINGUNGEN 44
2.2.5.3 PRIMER FUER SEQUENZIERUNG 52
2.2.6 FUER DIE KLONIERUNG DER LENTIVIRALEN EXPRESSIONSVEKTOREN DER GENE
CD79B, BLNK, INPP5D (SHIP) UND C-CBL VERWENDETE PRIMER 52
2.2.6.1 PRIMER ZUR HERSTELLUNG VON CDS DER GENE
CD79B, BLNK, INPP5D (SHIP) UND C-CBL 52
2.2.6.2 SITE-DIRECTED-MUTAGENESIS-PRIMER 53
2.2.6.3 PRIMER ZUR SEQUENZIERUNG DER IN PLENTI6.3-V5 INSERIERTEN GENE
CD79B, BLNK, C-CBL UND INPP5D (SHIP) 54
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3 ERGEBNISSE 57
3.1 IM BCR-PATHWAY INVOLVIERTE GENE MIT AS-AUSTAUSCH-MUTATIONEN 57
3.1.1 MUTATIONEN IN CD79B 57
3.1.2 MUTATIONEN IN SHIP 61
3.1.3 MUTATION IN C-CBL 63
3.1.4 MUTATION IN BLNK 64
3.2 KEINE MUTATIONEN IN DEN GENEN
PTEN, DOK3, SHP1, SHP2 UND CD79A 65
3.3 MUTATIONSHAEUFIGKEIT DER IM BCR-PATHWAY INVOLVIERTEN GENE 66
3.4 LENTIVIRALE EXPRESSIONSVEKTOREN MIT WILDTYPISCHEN UND MUTIERTEN
GENEN CD79B, INPP5D (SHIP), BLNK UND C-CBL 69
4 DISKUSSION 70
4.1 MUTATIONEN IN CD79B 70
4.2 MUTATION DES GENS INPP5D (SHIP) 73
4.3 MUTATION DES GENS C-CBL 74
4.4 MUTATION IN BLNK 75
4.5 MUTIERTE GENE IM BCR-PATHWAY 75
5 ZUSAMMENFASSUNG 77
6 LITERATURVERZEICHNIS 79
7 LEBENSLAUF 89
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