Strukturelle Determinanten der nichthomologen RNA-Rekombination bei Pestiviren:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Gießen
DVG Service
2012
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 PESTI VIREN 1
1.1.1 TAXONOMIE DER PESTIVIREN 1
1.1.2 PESTIVIREN: WIRTSSPEKTRUM, PATHOGENESE UND KLINIK 2
1.1.2.1 BOVINES VIRUSDIARRHOE VIRUS 1 UND2(BVDV-L UND-2) 3
1.1.2.2 KLASSISCHES SCHWEINEPEST VIRUS (KSPV) 4
1.1.2.3 BORDER DISEASE VIRUS DER SCHAFE (BDV) 5
1.1.3 MORPHOLOGIE UND GENOMAUFBAU DER PESTIVIREN 5
1.1.4 REPLIKATION UND VIRUSMORPHOGENESE 13
1.1.5 UNTERTEILUNG IN BIOTYPEN 14
1.2 REKOMBINATION IS
1.2.1 RNA-REKOMBINATION IM RAHMEN DER VIRUSEVOLUTION 15
1.2.2 HOMOLOGE, ABERRANTE HOMOLOGE UND NICHTHOMOLOGE RNA-REKOMBINATION
17 1.2.3 REKOMBINATION BEI PESTIVIREN 17
1.2.4 MODELLE FUER DIE RNA-REKOMBINATION 19
1.2.5 EINFLUSSFAKTOREN AUF DIE RNA-REKOMBINATION 21
1.2.6 RNA-SEKUNDAERSTRUKTUREN 23
1.2.7 EINFLUSS 5 13 TERMINALER GRUPPEN AUF DIE RNA-REKOMBINATION 25
1.3 SEISETZUNG DER ARBEIT 28
2 MATERIAL UND METHODEN 29
2.1 ZELLEN 29
2.1.1 EUKARYOTISCHE ZELLEN 29
2.1.2 PROKARYOTISCHE ZELLEN 29
2.2 VIRUSSTAEMME 29
2.3 REKOMBINANTE PLASMIDE 29
2.4 OLIGONUKLEOTIDE FUER REVERSE TRANSKRIPTION, POLYMERASEKETTENREAKTION,
GERICHTETE MUTATION, KLONIERUNG UND SEQUENZIERUNG 31
2.5 ANTIKOERPER UND KONJUGATE 33
2.6 NAEHRMEDIEN 33
2.6.1 ZELLKULTURMEDIEN 33
2.6.2 BAKTERIENKULTURMEDIEN 33
2.7 LOESUNGEN UND PUFFER 33
2.8 ZELLKULTURARBEITEN 34
2.8.1 ALLGEMEINE ZELLKULTURARBEITEN 34
2.8.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 34
2.8.3 VIRUSINFEKTION VON ZELLEN 34
2.8.4 TRANSFEKTION SYNTHETISCHER RNA IN ZELLEN UND DURCHFUEHRUNG DER
VERDUENNUNGSREIHEN ZUR QUANTIFIZIERUNG DER ENTSTANDENEN REKOMBINANTEN
VIREN 35
2.8.5 VIRUSTITRATION 36
2.8.6 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZ ZUM NACHWEIS VIRALEN ANTIGENS 36 2.9
MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 37
2.9.1 ANZUCHT VON BAKTERIEN 37
2.9.2 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN 37
2.9.3 TRANSFORMATION KOMPETENTER ZELLEN MIT PLASMID-DNA 38
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.9.4 MINI-PRAEPARATION DER PLASMID-DNA 38
2.9.5 MIDI-PRAEPARATION DER PLASMID-DNA 39
2.10 NUKLEINSAEURETECHNIKEN 40
2.10.1 PHENOL-/CHLOROFORMREINIGUNG UND ETHANOLFAELLUNG 40
2.10.2 PHOTOMETRISCHE KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEURELOESUNGEN
40 2.10.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON NUKLEINSAEUREN 41
2.10.4 RNA-TECHNIKEN 41
2.10.4.1 IN-VITRO TRANSKRIPTION * , 41
2.10.4.2 RNA-AUFREINIGUNG UBER SAEULEN 42
2.10.4.3 RNA-ISOLIERUNG AUS ZELLEN 43
2.10.4.4 RNA-ISOLIERUNG AUS ZELLKULTURIIBERSTAENDEN 43
2.10.4.5 REVERSE TRANSKRIPTION 44
2.10.4.6 MODIFIKATION AM 3 -TERMINUS DER RNA 44
2.10.4.7 MODIFIKATION AM S -TERMINUS DER RNA 45
2.10.5 DNA-TECHNIKEN 46
2.10.5.1 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 46
2.10.5.2 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 46
2.10.5.3 ENZYMATISCHE DNA SPALTUNG 47
2.10.5.4 PLASMID-LINEARISIERUNG FUER DIE SYNTHETISCHE TRANSKRIPTION 47
2.10.5.5 DNASEL-VERDAU 48
2.10.5.6 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN MIT T4-DNA-LIGASE 48
2.10.5.7 DNA SEQUENZIERUNG UND ANALYSE DER SEQUENZDATEN 48
2.10.5.8 KONSTRUKTION DER PLASMIDE FUER DIE HERSTELLUNG DER
REKOMBINATIONSPARTNER 49 2.10.6 ANALYSE DER RNA-STABILITAET 50
3 ERGEBNISSE 52.
3.1.1 KORRELATION ZWISCHEN RNA-TRANSKRIPTMENGE DES BVDV-1 GESAMTKLONS
CP7-388 UND DER ANZAHL UNABHAENGIGER INFEKTIONSEREIGNISSE 52
3.2 FREQUENZ DER PESTIVIRALEN, NICHTHOMOLOGEN RNA-REKOMBINATION UND IHRE
STRUKTURELLEN DETERMINANTEN 53
3.2.1 REKOMBINATIONSSYSTEM UND REKOMBINATIONSPARTNER 53
3.2.2 RNA-MENGEN BEIDER REKOMBINATIONSPARTNER BESTIMMEN DIE
REKOMBINATIONSFREQUENZ 56
3.2.3 ANALYSE DER REKOMBINATIONSORTE 57
3.2.4 EINFLUSS DER 3 PHOSPHAT- UND 5 HYDROXYL-GRUPPEN AUF DIE RNA-
REKOMBINATIONSFREQUENZ UND DIE STRUKTUR DER REKOMBINATIONSPRODUKTE 61
3.2.5 EINFLUSS TERMINALER 3 P UND 5 OH GRUPPEN DER
REKOMBINATIONSPARTNER AUF DEN ABBAU DER TRANSFIZIERTEN RNA IN DER ZELLE
67
3.3 UNTERSUCHUNGEN UEBER DEN EINFLUSS DER 5 -/3 -TERMINI VIRALER,
SUBGENOMISCHER REKOMBINATIONSPARTNER AUF DIE REKOMBINATION MIT EINEM
REPLIZIERENDEN PESTIVIRUS. 70 3.3.1 REKOMBINATIONSSYSTEM UND STRUKTUR
DER REKOMBINATIONSPARTNER 70 3.3.2 EINFLUSS DER 5 TERMINALEN GRUPPE
EINES SUBGENOMISCHEN TRANSKRIPTES AUF DIE
REKOMBINATION MIT EINEM REPLIZIERENDEN VIRUS 74
3.3.3 EINFLUSS DER 3 TERMINALEN GRUPPE EINES SUBGENOMISCHEN TRANSKRIPTES
AUF DIE REKOMBINATION MIT EINEM REPLIZIERENDEN VIRUS 78
4 DISKUSSION 84
4.1 MENGENABHAENGIGKEIT DER RNA-REKOMBINATION UND REKOMBINATIONSFREQUENZ
86 4.2 EINFLUSS DER RNA-SEKUNDAERSTRUKUR AUF DIE LOKALISATION DER
REKOMBINATIONSORTE 90
N
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.3 PRIMAERSEQUENZMOTIVE UND IHR EINFLUSS AUF DIE RNA-REKOMBINATION 92 4.4
INSERTION VON OLIGONUKLEOTIDEN AM REKOMBINATIONSORT 93
4.5 EINFLUSS 3 - UND 5 -TERMINALER GRUPPEN AUF DIE RNA-REKOMBINATION 94 5
ZUSAMMENFASSUNG 102
6 SUMMARY 104
7 LITERATURVERZEICHNIS 106
8 ANHANG 132
8.1 ZELLKULTURMEDIUM 132
8.2 BAKTERIENKULTURMEDIEN 132
8.3 LOESUNGEN UND PUFFER 133
8.4 CHEMIKALIEN 139
8.5. VERBRAUCHSMATERIALIEN 141
8.6 GERAETE 142
8.6.1 ZENTRIFUGEN 144
8.7 ENZYME 144
8.8 VORGEFERTIGTE SYSTEME ( KITS ) 145
9 ABBILDUNGS-, TABELLEN- UND ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 147
9.1 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 147
9.2 TABELLENVERZEICHNIS 148
9.3 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 148
10 PUBLIKATION, VORTRAEGE UND POSTER 152
10.1 PUBLIKATION: 152
10.2 VORTRAEGE: 152
10.3 POSTER: 152
11 DANKSAGUNG 153
III
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