Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des Eisen-Schwefel-Proteins IspH in Komplex mit Liganden:
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München
Verl. Dr. Hut
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 BIOLOGISCHE
EISEN-SCHWEFEL-CLUSTER.
1
1.1.1 HISTORISCHE ENTWICKLUNG 1
1.1.2 VIELFALT VON FE-S-CLUSTER 2
1.1.3 BIOSYNTHESE VON FE-S-CLUSTER 4
1.1.4 FUNKTIONEN VON FE-S-CLUSTER 6
1.2 ISOPRENOID BIOSYNTHESE 9
1.2.1 DER MEVALONSAEURE-BIOSYNTHESEWEG 10
1.2.2 DER DESOXYXYLULOSE-5-PHOSPHAT-BIOSYNTHESEWEG 11
1.2.3 REAKTIVITAET UND STRUKTUR DES PROTEINS ISPH 12
1.2.4 ISOPRENOID-BIOSYNTHESE ALS TARGET FUER ANTIBIOTIKA 17
2 AUFGABENSTELLUNG 19
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 MATERIAL
.21
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
. . 31
3.2.1 POLYMERASE KETTENREAKTION 31
3.2.2 RESTRIKTIONSVERDAU 32
3.2.3 LIGATION 32
3.2.4 TRANSFORMATION 33
3.2.5 PLASMIDISOLIERUNG 33
3.2.6 SEQUENZIERUNG 33
3 3 PROTEINCHEMISCHE
METHODEN.34
3.3.1 STAMMHALTUNG 34
3.3.2 EXPRESSIONSTESTS 34
3.3.3 ANZUCHT VON EXPRESSIONSKLONEN 34
3.3.4 ZELLAUFSCHLUSS 35
3.3.5 PROTEINREINIGUNG 35
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.6 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 36
3.3.7 REKONSTITUTION DES EISEN-SCHWEFEL-CLUSTERS 36
3.3.8 SAUERSTOFF-SENSITIVITAETSASSAY 37
3.4 PHYSIKALISCHE METHODEN 38
3.4.1 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 38
3.4.2 SDS-PAGE 38
3.4.3 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE 38
3.5 NMR-BASIERTE ENZYMAKTIVITAETSBESTIMMUNG 39
3.5.1 ASSAY MIT [1,2,4- 13C 3]-HMBPP 39
3.5.2 ASSAY MIT FMBPP 40
3.6 ROENTGENSTRUKTURANALYTISCHE
METHODEN. 41
3.6.1 KRISTALLISATION 41
3.6.2 DATENSAMMLUNG UND AUSWERTUNG 41
3.6.3 MODELLBAU UND VERFEINERUNG 42
3.6.4 EINBAU VON LIGANDEN 43
3.6.5 GRAPHISCHE DARSTELLUNG 43
4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 45
4.1 KIONIERUNG UND EXPRESSION VON ISPH AUS A. AEOTTCUS, & COLI SOWIE
ISPHL UND ISPH2 AUS M. TUBERCULOSIS 45
4.2 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER ISPH-PROTEINE 47
4.3 KRISTALLISATION UND DATENSAMMLUNG . 52
4.4 STRUKTURANALYSE VON ISPH IN KOMPLEX MIT NATUERLICHEN LIGANDEN 55
4.5 STRUKTURELLE CHARAKTERISIERUNG DER
ISPH-MUTANTENPROTEINE. 61
4.6 MECHANISTISCHE UNTERSUCHUNGEN MIT
SUBSTRATANALOGA. 64
4.7 STRUKTURBESTIMMUNG VON E. COLI ISPH IN KOMPLEX MIT
INHIBITOREN. 70
5 ZUSAMMENFASSUNG 85
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
6 LITERATURVERZEICHNIS 89
7 ANHANG 97
7.1 ALIGNMENT DER
ISPH-PROTEINSEQUENZEN.
97
7.2 DATENSAMMLUNGS- UND V ERFEINERUNGSSTATISTIKEN 98
7.3 19F-NMR-SPEKTREN MIT ()-4-FLUORO-3-METHYLBUT-2-ENDIPHOSPHAT 104 |
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