Funktionelle Aspekte von P-Cadherin bei der Progression des oralen Plattenepithelkarzinoms:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ZUSAMMENFASSUNG 1
2 EINLEITUNG 3
2.1 DAS ORALE EPITHEL 3
2.1.1 AUFBAU UND FUNKTION DES ORALEN EPITHELS 3
2.1.2 AUFBAU UND FUNKTION DER KERATINE 4
2.1.S DIFFERENZIERUNG DER KERATINOZYTEN 5
2.2 DAS ORALE PLATTENEPITHELKARZINOM 5
2.2.1 EPIDEMIOLOGIE 5
2.2.2 AETIOLOGIE UND RISIKOFAKTOREN 6
2.2.3 TUMORGENESE T 7
2.3 CADHERINE 9
2.3.1 AUFBAU UND FUNKTION DER CADHERINE 9
2.3.2 AUFBAU UND FUNKTION VON P-CADHERIN 12
2.4 DER WNT/BETA-CATENIN-SIGNAIWEG 13
2.5 DIE EPITHELIAL-MESENCHYMALE TRANSITION 14
2.6 DER SLIT/ROBO-SIGNALWEG 16
2.6.1 AUFBAU UND FUNKTION DER SLIT- UND ROBO-PROTEINE 16
2.6.2 DIE ROLLE DES SLIT/ROBO-SIGNALWEGS AUSSERHALB DES NERVENSYSTEMS 18
2.6.3 DIE ROLLE VON SLIT-2 IM TUMOR 19
3 MATERIAL UND METHODEN 21
3.1 ZELLKULTURMETHODEN 2 1
3.1.1 ISOLIERUNG PRIMAERER, ORALER KERATINOZYTEN AUS GESUNDEM, MUKOSALEM
BZW. OSCC-GEWEBE 21 3.1.2 KULTIVIERUNG DER ZELLLINIEN 21
3.1.3 TRANSFEKTION 22
3.1.3.1 STABILE TRANSFEKTION 22
3.1.3.2 TRANSIENTE TRANSFEKTION 23
3.1.4 MIGRATIONSEXPERIMENTE 24
3.1.5 INHIBIERUNG VON GSK3-BETA 25
3.1.5.1 INHIBIERUNG VON GSK3-BETA MIT HILFE DES INHIBITORS BIO 25
3.1.5.2 INHIBIERUNG VON GSK3-BETA MIT HILFE VON LITHIUMCHLORID 25
3.1.6 INHIBIERUNG DES BETA-CATENIN/LEVTCF-KOMPLEXES 25
3.1.7 C/EBP-BETA LUCIFERASE REPORTER GEN ASSAY 25
3.1.8 DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE 26
3.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 26
3.2.1 KIONIERUNG 26
3.2.2 RNA-ISOLIERUNG 27
3.2.2.1 RNA-ISOLIERUNG AUS ZELLEN 27
3.2.2.2 RNA-ISOLIERUNG AUS GEWEBE 27
3.2.3 REVERSE TRANSKRIPTION 28
3.2.4 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTENREAKTION 28
3.2.4.1 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTENREAKTION MIT SYBRGREEN 28
3.2.4.2 QUANTITATIVE POLYMERASE-KETTENREAKTION MIT TAQMAN-SONDEN 29
3.2.5 HUMANER STAMMZELL-ARROY 31
3.2.6 ISOLIERUNG GENOMISCHER DNA, BISULFIT-MODIFIKATION UND ANALYSE DES
E-CADHERIN-PROMOTORS MIT HILFE VON METHYLIERUNGSSPEZIFISCHER
POLYMERASE-KETTENREAKTION 32
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN 33
3.3.1 PROTEINGEWINNUNG AUS ZELLEN 33
3.3.2 PROTEINQUANTIFIZIERUNG 34
3.3.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 34
3.3.4 WESTERN BLOT 35
3.3.5 PROTEINDETEKTION AUF WESTERN BLOTS 35
3.3.6 IMMUNPRAEZIPITATION 35
3.3.6.1 IMMUNPRAEZIPITATION MIT MAGNETISCHEN MICROBEADS 35
3.3.6.2 IMMUNPRAEZIPITATION MIT SEPHAROSE PROTEIN A BEADS 36
3.3.7 PROTEIN-DEPHOSPHORYLIERUNG MIT LOMBDO-PROTEINPHOSPHATASE 36
3.3.8 GEWEBESCHNITTE 36
3-.3.9 IMMUNHISTOCHEMIE 37
3.3.10 IMMUNZYTOCHEMIE 37
3.3.11 IMMUNFLUORESZENZ 37
3.3.12 PROXIMITY LIGATION ASSAY 38
3.3.13 ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY 39
3.3.14 MIKROSKOP 39
3.4 STATISTISCHE AUSWERTUNG 40
4 ERGEBNISSE 41
TEIL 1 4 1
4.1 DIE ROLLE VON P-CADHERIN IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 4 1
4.1.1 EXPRESSION VON P-CADHERIN IN DER ORALEN MUKOSA UND IM OSCC 4 1
4.1.2 EXPRESSION VON P-CADHERIN IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 42
4.1.3 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE ZELLMORPHOLOGIE 43
4.1.4 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF EMT-MARKER SOWIE AUF DIE ZELLMIGRATION
44
4.2 DIE ROLLE VON SNAIL IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 46
4.2.1 EXPRESSION VON SNAIL IM OSCC SOWIE IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 46
4.2.2 EINFLUSS DES P-CADHERIN- BZW. SNAIL-KNOCKDOWNS AUF DIE
ZELLMORPHOLOGIE SOWIE AUF DIE SNAILLOKALISATION 47
4.2.3 EINFLUSS VON SNAIL AUF DIE E-CADHERIN-EXPRESSION 48
4.2.4 UNTERSUCHUNG DES E-CADHERIN-PROMOTORS 49
4.3 DIE ROLLE VON GSK3-BETA IN DER OSCC-ZELLLINIE PCIS2 50
4.3.1 NACHWEIS DER GSK3-BETA/SNAIL-LNTERAKTION 50
4.3.2 EINFLUSS DER GSK3-BETA-AKTIVITAET AUF DIE SNAIL-PHOSPHORYLIERUNG 51
4.4 ZUSAMMENFASSUNG TEIL I 52
TEIL II 53
4.5 DIE ROLLE VON SLIT-2 IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 53
4.5.1 EXPRESSION VON SLIT-2 IN DER ORALEN MUKOSA UND IM OSCC 53
4.5.2 EXPRESSION VON SLIT-2 IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 55
4.5.3 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE SLIT-2-SEKRETION 56
4.5.4 EINFLUSS VON SLIT-2 AUF DEN WNT-SIGNALWEG 57
4.5.5 EINFLUSS VON SLIT-2 AUF DIE ZELLMIGRATION 58
4.6 DIE ROLLE VON ROBO-3 IN DER OSCC-ZELLLINIE PCI52 59
4.6.1 EXPRESSION VON ROBO-3 IN DER ORALEN MUKOSA 59
4.6.2 NACHWEIS DER P-CADHERIN/ROBO-3-INTERAKTION 59
4.6.3 EINFLUSS DES ROBO-3-KNOCKDOWNS AUF DIE ZELLMIGRATION 61
4.6.4 NACHWEIS DER ROBO-3/ABL-INTERAKTION 62
4.7 ZUSAMMENFASSUNG TEIL II 63
TEIL III 64
4.8 DIE ROLLE VON P-CADHERIN BEI DER KERATIN-EXPRESSION 64
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.8.1 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE KERATIN-1- UND
KERATIN-10-EXPRESSION 64
4.8.2 EINFLUSS VON E-CADHERIN AUF DIE KERATIN-1- UND
KERATIN-10-EXPRESSION 67
4.8.3 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE KERATIN-5- UND
KERATIN-14-EXPRESSION 69
4.8.4 EINFLUSS VON GSK3-BETA AUF DIE KERATIN-1- UND
KERATIN-10-EXPRESSION 70
4.8.5 EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE EXPRESSION UND LOKALISATION VON
C/EBP-BETA 71
4.9 DER EINFLUSS VON P-CADHERIN AUF DIE PROLIFERATION VON KERATINOZYTEN
73
4.10 ZUSAMMENFASSUNG TEIL III 76
5 DISKUSSION 78
5.1 P-CADHERIN UND DER GSK3-BETA/SNAIL-SIGNALWEG 78
5.2 P-CADHERIN UND DER SLIT/ROBO-SIGNALWEG 82
5.3 P-CADHERIN UND DIE REGULATION DER KERATIN-1- UND
KERATIN-10-EXPRESSION 87
6 LITERATURVERZEICHNIS 92
ANHANG 101
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 101
ANTIKOERPERLISTE 103
DANKSAGUNG 105
ERKLAERUNG 106
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