Identifizierung einer Aminosäure im Transportweg des organischen Kationentransporters 1, deren Mutation Strukturänderungen beim Transport beeinflusst:
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. ZUSAMMENFASSUNG 1
1.1. ZUSAMMENFASSUNG 1
1.2. SUMMARY 3
2. EINLEITUNG 5
2.1. DIE ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTER 5
2.1.1. STRUKTUR DER ORGANISCHEN KATIONENTRANSPORTER 8
2.1.2. SUBSTRATBINDUNG UND TRANSLOKATION ORGANISCHER KATIONENTRANSPORTER
9
2.1.3. ROCTL(LOACYS), EINE CYSTEIN-SUBSTITUTIONSMUTANTE 15
2.2. ZIELSETZUNG 17
3. MATERIAL & METHODEN 18
3.1. MATERIALIEN 18
3.1.1. CHEMIKALIEN 18
3.1.2. RADIOAKTIVE CHEMIKALIEN 18
3.1.3. ENZYME, KOMMERZIELLE PUFFER UND MARKER 18
3.1.4. REAGENZIENSETS (KITS) 19
3.1.5. LOESUNGEN, PUFFER UND MEDIEN 19
3.1.6. BIOLOGISCHE MATERIALIEN 2 1
3.1.6.1. BAKTERIENSTAEMME 2 1
3.1.6.2. ZELLEN 22
3.1.6.3. SUEDAFRIKANISCHE KRALLENFROESCHE (XENOPUS LAEVIS) 22
3.1.7. SOFTWARE 22
3.2. METHODEN 22
3.2.1. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 22
3.2.1.1. HERSTELLUNG DER ROCTL-KONSTRUKTE 22
3.2.1.2. PRAEPARATION UND LINEARISIERUNG DER CDNA 23
I
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.1.3. RNA-SYNTHESE DURCH IN VITRO TRANSKRIPTION 24
3.2.2. EXPRESSION UND ANALYSE VON ROCTL-MUTANTEN IN XENOPUS LAEVIS
OOZYTEN 25
3.2.2.1. PRAEPARATION UND INJEKTION DER X. LAEVIS OOZYTEN 25
3.2.2.2. MESSUNGEN DER SUBSTRATAUFNAHME DER X. LAEVIS OOZYTEN 26
3.2.3. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 27
3.2.3.1. PRAEPARATION DER MEMBRANFRAKTION VON X. LAEVIS OOZYTEN 27
3.2.3.2. DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE) 27
3.2.3.3. WESTERN-BLOT-ANALYSE 28
3.2.4. ELEKTROPHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN 29
3.2.4.1. ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME (TEVC) 29
3.2.4.2. BESTIMMUNG DER MEMBRANKAPAZITAETEN 30
3.2.4.3. CYSTEIN-SPEZIFISCHE MARKIERUNG DER ROCTL-MUTANTEN 30
3.2.4.4. ZWEI-ELEKTRODEN-SPANNUNGSKLEMME-FLUOROMETRIE 3 1
3.2.5. EXPRESSION UND ANALYSE VON ROCTL-MUTANTEN IN HUMAN EMBRYONIC
KIDNEY-293
(HEK293)-ZELLEN 33
3.2.5.1. ZELLKULTUR 33
3.2.5.2. MESSUNGEN DER SUBSTRATAUFNAHME DER HEK293-ZELLEN 33
3.2.5.3. BINDUNGSMESSUNGEN IN HEK293-ZELLEN 34
3.2.6. BERECHNUNGEN UND STATISTIKEN 35
4. ERGEBNISSE 36
4.1. IDENTIFIZIERUNG VON POSITIONEN IN ROCTL, DIE SPANNUNGSABHAENGIGE
FLUORESZENZAENDERUNGEN ZEIGEN 36
4.1.1. CHARAKTERISIERUNG DER SPANNUNGSABHAENGIGEN FLUORESZENZAENDERUNGEN
IN TMH 5,
8 UND 11 39
4.1.2. FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER CYSTEINMUTANTEN
ROCTL(10ACYS-P260C),
ROCTL(10ACYS-F380C) UND ROCTL(!OACYS-F483C) 42
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.3. EINFLUSS DES FLUORESZENZFARBSTOFFS TMR6M AUF DIE FUNKTIONELLEN
EIGENSCHAFTEN
DER CYSTEINMUTANTEN ROCTL(10ACYS-P260C), ROCTL(10ACYS-F380C) UND
RC CTL(10ACYS-F483C) 45
4.2. BLOCKIERUNG DES TRANSPORTWEGS VON ROCTL(LOACYS) 48
4.2.1. ROCTL UND ROCTL(LOACYS) TRANSPORTIEREN MTSET 48
4.2.2. IDENTIFIZIERUNG EINER CYSTEINMUTANTE, DURCH DIE DER TRANSPORT VON
ROCTL(LOACYS) IRREVERSIBEL BLOCKIERT WERDEN KANN 49
4.2.3. DURCH DIE MUTATION IN POSITION 478 WIRD DIE
TRANSPORTGESCHWINDIGKEIT VON
ROCTL ERNIEDRIGT 52
4.2.4. EINFLUSS DES CYSTEINS 478 AUF DIE K M -UND IC 50 -WERTE
VERSCHIEDENER ORGANISCHER
KATIONEN 53
4.2.5. TMA UND CHOLIN HEMMEN DIE KOVALENTE MODIFIZIERUNG DES CYSTEIN 478
DURCH
MTSET 55
4.2.6. DIE ZUGAENGLICHKEIT DES CYSTEINS 478 IST SPANNUNGSABHAENGIG 57
4.2.7. DAS CYSTEIN 478 IST VON AUSSEN ZUGAENGLICH 58
4.2.8. DURCH DIE MODIFIZIERUNG MIT MTSET WIRD DIE MUTANTE
ROCTL(10ACYS-G478C)
VOLLSTAENDIG INHIBIERT 59
4.2.9. DURCH DIE MODIFIKATION VON RC CTL(10ACYS-G478C) WIRD DIE BINDUNG
VON MPP
BLOCKIERT 62
4.3. SPANNUNGSABHAENGIGE FLUORESZENZAENDERUNGEN VON ROCTL WERDEN DURCH DIE
POSITION
478 BEEINFLUSST 64
4.3.1. DER AUSTAUSCH DES GLYCINS 478 DURCH EIN CYSTEIN VERAENDERT DIE
BEWEGUNGEN IN
DEN POSITIONEN 260 UND 483 64
4.3.2. FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER CYSTEINDOPPELMUTANTEN
ROCTL(10ACYSP260C-G478C), ROCTL(10ACYS-F380C-G478C) UND
RC CTL(10ACYS-F483C-G478C)
65
4.3.3. DIE AKTIVITAET DER MUTANTE ROCTL(10ACYS-G478C) WIRD DURCH DEN
FLUORESZENZFARBSTOFF TMR6M NICHT BEEINFLUSST 68
III
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.4. VERIFIZIERUNG DES EINFLUSSES DER AMINOSAEURE IN DER POSITION 478
AUF DIE
SPANNUNGSABHAENGIGEN FLUORESZENZAENDERUNGEN VON ROCTL 69
4.3.5. DIE MUTATIONEN IN DER POSITION 478 BEEINFLUSSEN DIE
GESCHWINDIGKEIT DER
SPANNUNGSABHAENGIGEN FLUORESZENZAENDERUNGEN 7 1
4.3.6. DIE BLOCKIERUNG DES TRANSPORTWEGS VON ROCTL DURCH MTSET VERAENDERT
DIE
SPANNUNGSABHAENGIGEN FLUORESZENZAENDERUNGEN IN POSITION 380 73
4.3.7. DIE BLOCKIERUNG DES TRANSPORTWEGS VON ROCTL DURCH MTSET VERAENDERT
DIE
KATIONENABHAENGIGEN FLUORESZENZAENDERUNGEN IN POSITION 380 UND 483 74
4.3.8. KEINE BEEINFLUSSUNG DER GESCHWINDIGKEIT DER KATIONENABHAENGIGEN
FLUORESZENZAENDERUNGEN DURCH DIE MUTATIONEN IN DER POSITION 478 79
4.3.9. MTSET HAT KEINEN EINFLUSS AUF DIE SPANNUNGSABHAENGIGEN
FLUORESZENZAENDERUNGEN DER EINZELMUTANTEN 8 1
5. DISKUSSION 8 6
5.1. IDENTIFIZIERUNG VON SPANNUNGSABHAENGIGEN KONFORMATIONSAENDERUNGEN 87
5.2. SPANNUNGSABHAENGIGE KONFORMATIONSAENDERUNGEN IN ANWESENHEIT VON
ORGANISCHEN
KATIONEN 89
5.3. BLOCKIERUNG DES TRANSPORTWEGS VON ROCTL 9 1
5.4. BEEINFLUSSUNG DER SPANNUNGSABHAENGIGEN KONFORMATIONSAENDERUNGEN NACH
MUTATION
DES GLYCINS IN POSITION 478 97
5.5. BEEINFLUSSUNG DER SPANNUNGSABHAENGIGEN KONFORMATIONSAENDERUNGEN NACH
MUTATION
DES GLYCINS 478 IN ANWESENHEIT VON ORGANISCHEN KATIONEN 99
5.6. BEEINFLUSSUNG DER SPANNUNGSABHAENGIGEN KONFORMATIONSAENDERUNGEN NACH
BLOCKIERUNG DES TRANSPORTWEGS VON ROCTL 100
6. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 105
7. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 108
8. REFERENZEN 1 1 1
9. DANKSAGUNG 1 2 1
EIDESSTATTLICHE ERKLAERUNG 122
IV |
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