Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes und dessen Metabolit auf NO und NO-Synthasen:
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| Published: |
2012
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
A EINLEITUNG 17
1 STICKSTOFFMONOXID (NO) 17
2 POLYPHENOLE UND FLAVONOIDE 21
3 NO-STOFFWECHSEL UND -NACHWEISMETHODEN 24
B ALLGEMEINER TEIL 29
1 INDUZIERBARE NO-SYNTHASE (INOS) 29
1.1 NO UND ENTZUENDUNG 29
1.2 FLAVONOIDE DES KIEFERNRINDENEXTRAKTES, METABOLIT M1 UND ENTZUENDUNG
31
1.2.1 FRAGESTELLUNG: EFFEKTE VON M1 AUF INOS UND NO-FREISETZUNG 33
1.2.2 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 34
1.2.3 ERGEBNISSE ZYTOTOXIZITAET VON M1 34
1.2.4 DISKUSSION ZYTOTOXIZITAET VON M1 37
1.2.5 ERGEBNISSE DER HEMMUNG DER NO-FREISETZUNG UND DER INOS-LNDUKTION
AUS MAKROPHAGEN DURCH M1 38
1.2.6 DISKUSSION DES EINFLUSSES VON M1 AUF NO UND INOS 44
1.2.6.1 RADIKALFAENGER-EIGENSCHAFTEN VON UND HEMMUNG DER
NITRIT-FREISETZUNG DURCH M1 44
1.2.6.2 HEMMUNG DER INOS-LNDUKTION DURCH M1 47
1.3 AD-/ABSORPTION DES METABOLITEN M1 AN/IN MURINE MAKROPHAGEN, HUMANE
ENDOTHELZELLEN UND PRIMAERE HUMANE MONOZYTEN 50
1.3.1 FRAGESTELLUNG: ZELLULAERE AD-/ABSORPTION VON M1 52
1.3.2 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 53
1.3.3 ERGEBNISSE 54
1.3.3.1 AD-/ABSORPTION VON M1 AN/IN MURINE MAKROPHAGEN UND HUMANE
MONOZYTEN.... 54
1.3.3.2 AD-/ADSORPTION VON M1 AN/IN HUMANE ENDOTHELZELLEN 56
1.3.4 DISKUSSION 57
2 ENDOTHELIALE NO-SYNTHASE (ENOS) 62
2.1 NO UND DAS GEFAESSSYSTEM 62
2.2 FLAVONOIDE UND GEFAESSSYSTEM 64
2.2.1 FRAGESTELLUNG: EFFEKTE VON FLAVONOIDEN AUF DIE ENOS IN
ENDOTHELZELLEN 66
2.2.2 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 67
2.2.3 ERGEBNISSE 67
11
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3.1 KURZZEIT-EFFEKTE AUF DIE NO-FREISETZUNG 67
2.2.3.2 LANGZEITEFFEKTE AUF DIE NO-FREISETZUNG UND
ENOS-PROTEINEXPRESSION 68
2.2.4 DISKUSSION 72
2.2.5 FRAGESTELLUNG: EINFLUSS DES KIEFERNRINDENEXTRAKTES AUF METHYLIERTE
ARGININE UND ENDOTHELIN-1 ALS RISIKOFAKTOREN DER ENDOTHELIALEN
DYSFUNKTION IN VIVO 77
2.2.5.1 ENDOGENE INHIBITOREN VON NO-SYNTHASEN 77
2.2.5.2 ENDOTHELIN-1 79
2.2.6 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 80
2.2.7 ERGEBNISSE 81
2.2.7.1 IN VITRO : VORUNTERSUCHUNGEN 81
2.2.7.2 IN VIVO KLINISCHE STUDIE 83
2.2.8 DISKUSSION 86
2.2.8.1 IN VITRO : VORUNTERSUCHUNGEN 86
2.2.8.2 IN VIVO: KLINISCHE STUDIE 89
2.3 NEUE METHODISCHE ASPEKTE DER NO-QUANTIFIZIERUNG 93
2.3.1 STABILITAET DER UNTERSUCHTEN SUBSTANZEN UNTER TESTBEDINGUNGEN 93
2.3.1.1 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 94
2.3.2 EIGNUNG DER NEUEN HPLC-METHODE ZUR EMPFINDLICHEN QUANTIFIZIERUNG
VON DURCH ENDOTHELZELLEN PRODUZIERTEM NO 98
2.3.2.1 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 98
2.3.3 UMSATZ-EFFIZIENZ VON DAF-2 MIT NO IN ASSAY-PUFFER UND IN GEGENWART
VON ZELLEN 101
2.3.3.1 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 101
2.3.4 STABILITAET DER FLUORESZENZSONDE DAF-2 UNTER TEST- UND
LAGERUNGSBEDINGUNGEN 104
2.3.4.1 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 105
2.3.5 DISPARITAETEN DES NO-ANSPRECHVERMOEGENS BEIM VERGLEICH VERSCHIEDENER
DETEKTIONSSYSTEME 113
2.3.5.1 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 113
3 NEURONALE NO-SYNTHASE (NNOS) 117
3.1 NO UND DAS GEHIRN 117
3.2 FLAVONOIDE UND DAS GEHIRN 118
3.2.1 FRAGESTELLUNG: MOEGLICHE ZEREBRALE AUFNAHME VON M1 UND EFFEKTE AUF
NNOSEXPRESSION 122
3.2.2 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 122
3.2.3 ERGEBNISSE 123
3.2.3.1 WESTERN-BLOTTING 123
12
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.3.2 COMPUTER-BASIERTE VORHERSAGE DER BLUT-HIRNSCHRANKENGAENGIGKEIT
124
3.2.4 DISKUSSION 129
4 EINFLUSS EINES NONI-EXTRAKTES AUF DIE MMP-9 SEKRETION AUS HUMANEN,
PRIMAEREN MONOZYTEN 134
4.1 DIE MEDIZINISCHE ANWENDUNG DER NONI-PFLANZE 134
4.2 KLINISCHE STUDIEN MIT NONI-PRODUKTEN 135
4.3 ARTHROPATHIEN, MMP-9 UND PFLANZENEXTRAKTE 136
4.4 FRAGESTELLUNG: EFFEKTE DES NONI-EXTRAKTES AUF MONOZYTAERE MMP-9
SEKRETION 138
4.5 PRINZIPIEN DER BESTIMMUNG UND METHODIK 138
4.6 ERGEBNISSE 139
4.7 DISKUSSION 140
C MATERIAL UND METHODEN 145
1 HAEUFIG VERWENDETE REAGENZIEN, GERAETE UND PUFFER 145
1.1 REAGENZIEN 145
1.2 STAMMLOESUNGEN 146
1.3 GERAETE 146
1.4 PUFFER 147
2 UNTERSUCHUNGEN DER INOS 148
2.1 SPEZIELLE MATERIALIEN, CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 148
2.2 ZELLKULTUR 148
2.3 MEDIEN 148
2.4 ROUTINEMETHODEN DER ZELLKULTUR 149
2.4.1 EINFRIEREN UND AUFTAUEN 149
2.4.2 PASSAGIEREN UND KULTIVIEREN 150
2.4.3 ZELLZAEHLUNG UND VITALITAETSTEST 150
2.5 ZYTOTOXIZITAETS-TESTUNG MIT NEUTRAL ROT 150
2.6 NITRIT-MESSUNG MIT MODIFIZIERTER GRIESS-REAKTION 151
2.7 NITRIT-MESSUNG ALS S-NITROSO-A/-ACETYLCYSTEIN 152
2.8 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD 153
2.9 WESTERN-BLOTTING 154
2.9.1 ZELL-LYSE 154
2.9.2 GELELEKTROPHORESE 156
2.9.3 SEMIDRY-BLOTTING 158
3 BESTIMMUNG DER AD-/ABSORPTION DES METABOLITEN M1 AN/IN PRIMAERE, HUMANE
MONOZYTEN UND ENDOTHELZELLEN 160
13
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.1 SPEZIELLE MATERIALIEN, CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 160
3.2 HPLC-METHODE ZUR DIREKTEN BESTIMMUNG VON M1 IN ZELLKULTURUEBERSTAENDEN
UND LYSATEN 161
3.2.1 HPLC-GERAETE UND BEDINGUNGEN 161
3.2.2 VALIDIERUNGSPARAMETER DER M1 HPLC-METHODE 161
3.2.2.1 SELEKTIVITAET/SPEZIFITAET 161
3.2.2.2 LINEARITAET/KALIBRIERFUNKTION 162
3.2.2.3 PRAEZISION UND RICHTIGKEIT 163
3.2.2.4 BESTIMMUNGSGRENZE (LLOQ) 164
3.2.2.5 STABILITAET 164
3.2.3 VERSUCHSBEDINGUNGEN UND VORGEHENSWEISE 165
3.2.3.1 MONOZYTEN/MAKROPHAGEN 165
3.2.3.2 EA.HY 926 166
4 UNTERSUCHUNGEN DER ENOS ...167
4.1 SPEZIELLE MATERIALIEN,CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 167
4.2 ZELLKULTUR 168
4.3 MEDIEN 168
4.4 ROUTINEMETHODEN DER ZELLKULTUR 168
4.4.1 EINFRIEREN UND AUFTAUEN 168
4.4.2 PASSAGIEREN UND KULTIVIEREN 168
4.4.3 ZELLZAEHLUNG UND VITALITAETSTEST 169
4.5 L-ARGININ-ABHAENGIGKEIT DER NO-PRODUKTION DER ENOS 169
4.6 STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN UND FLUORIMETRISCHE AKTIVITAET VON
(+)-CATECHIN, (-)EPICATECHIN, RESVERATROL UND M1 169
4.7 ENTWICKLUNG EINER HPLC-METHODE ZUR STOERUNGSFREIEN MESSUNG DER
NOFREISETZUNG KONSTITUTIVER NO-SYNTHASE IM ZELLKULTURSYSTEM 170
4.7.1 HPLC-GERAETE UND BEDINGUNGEN 170
4.7.2 VERSUCHSBEDINGUNGEN UND VORGEHENSWEISE 170
4.7.3 VALIDIERUNG DER DAF-2 HPLC-METHODE 171
4.7.3.1 VALIDIERUNGSPLAN 171
4.7.3.2 LINEARITAET UND BESTIMMUNGSGRENZEN (LLOQS) DES SYSTEMS 172
4.7.3.3 STABILITAETSUNTERSUCHUNGEN VON DAF-2 UND DAF-2T 176
4.7.3.4 LC-MS/MS ANALYTIK: QUALITATIVE VERIFIZIERUNG DER
HINTERGRUND-KONVERSION VON DAF-2 177
4.8 WESTERN-BLOTTING 177
4.9 UNTERSUCHUNG VON DISPARITAETEN DES NO-ANSPRECHVERMOEGENS BEIM
VERGLEICH VERSCHIEDENER DETEKTIONSSYSTEME 178
14
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
5 UNTERSUCHUNGEN METHYLIERTER ARGININ-DERIVATE IN PLASMAPROBEN MITTELS
KOMPETITIVEM ELISA-SYSTEM 178
5.1 STUDIENPOPULATION, -DESIGN UND -PROTOKOLL 178
5.2 KOMPETITIVES ELISA-TEST-SYSTEM FUER ADMA UND SDMA 179
5.3 AUSWERTUNG UND NICHT-LINEARE REGRESSION 180
6 UNTERSUCHUNG VON ENDOTHELIN-1 (ET-1) IN PLASMAPROBEN MITTELS
SANDWICHELISA 181
6.1 STUDIENPOPULATION, -DESIGN UND -PROTOKOLL 181
6.2 PROBENAUFARBEITUNG UND EXTRAKTION 181
6.3 SANDWICH-ELISA-SYSTEM FUER ENDOTHELIN-1 (ET-1) 181
7 UNTERSUCHUNGEN DER NNOS 182
7.1 SPEZIELLE MATERIALIEN, CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 182
7.2 ZELLKULTUR 182
7.3 MEDIEN 182
7.4 ROUTINEMETHODEN DER ZELLKULTUR 182
7.5 WESTERN-BLOTTING 183
7.6 COMPUTER-BASIERTE ENTWICKLUNG EINES MODELLS ZUR VORHERSAGE DES
BLUTHIRNSCHRANKEN-UEBERTRITTS AUSGEWAEHLTER FLAVONOIDE UND METABOLITE 183
7.6.1 VERWENDETE PROGRAMME 183
7.6.2 VERWENDETE MOLEKULARE DESKRIPTOREN (MOE) 184
7.6.3 DATENSAETZE 185
7.6.4 AUFBAU DES MODELLS 186
8 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES EINES NONI-EXTRAKTES AUF DIE MMP-9
FREISETZUNG AUS PRIMAEREN, HUMANEN MONOZYTEN 187
8.1 SPEZIELLE MATERIALIEN, CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 187
8.1.1 TRENNLOESUNGEN ZUR MODIFIZIERTEN, ISOPYKNISCHEN DICHTEGRADIENTEN-
ZENTRIFUGATION 187
8.2 MEDIEN 187
8.3 ISOLIERUNG HUMANER MONOZYTEN 188
8.4 VERSUCHSBEDINGUNGEN, INKUBATION UND STIMULATION DER MONOZYTEN 189
8.5 BESTIMMUNG DER MMP-9 KONZENTRATION IM ZELLKULTURUEBERSTAND MITTELS
SANDWICHELISA SYSTEM 189
D TABELLARISCHER ANHANG 191
1 ZYTOTOXIZITAET VON M1 IN MURINEN MAKROPHAGEN (RAW 264.7) 191
2 INHIBIERUNG DER NO-FREISETZUNG MURINER MAKROPHAGEN (RAW 264.7) DURCH
M1 192
15
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS
2.1 INHIBIERUNG DER NO-FREISETZUNG DURCH M1 IM VERGLEICH ZU
HYDROCORTISON UND FRAKTION I DES KIEFERNRINDENEXTRAKTES 192
2.2 KONZENTRATIONSABHAENGIGKEIT DER INHIBIERUNG DER NO-FREISETZUNG AUS
MURINEN MAKROPHAGEN DURCH M1 193
2.3 DENSITOMETRISCHE AUSWERTUNG DER WESTERN-BLOTS ZUR UNTERSUCHUNG DES
EINFLUSSES VON M1 AUF DIE INOS-PROTEINEXPRESSION 194
3 SORPTION M1 AN/IN HUMANE MONOZYTEN, ENDOTHELZELLEN UND MURINE
MAKROPHAGEN 194
3.1 HUMANE PRIMAERE MONOZYTEN 194
3.2 MURINE MAKROPHAGEN (RAEW 264.7) 195
3.3 HUMANE ENDOTHELZELLEN (EA.HY 926) 195
3.4 VERHAELTNISSE DER KONTROLLVERSUCHE MIT UND OHNE PHLORETIN 196
4 EINFLUESSE VON (+)-CATECHIN, METABOLIT M1 UND RESVERATROL AUF DIE
NOFREISETZUNG AUS ENDOTHELZELLEN 197
4.1 AKUTE, KURZZEITIGE EFFEKTE AUF DIE NO-FREISETZUNG 197
4.2 LANGZEIT-EFFEKTE AUF DIE NO-FREISETZUNG 198
5 EINFLUSS VON L-ARGININ-ASPARTAT AUF DIE NO-FREISETZUNG AUS
ENDOTHELZELLEN ....198
6 ADMA-FREISETZUNG AUS ENDOTHEL- UND RHADOMYOSARKOMZELLEN 199
7 ADMA-, SDMA-, UND ET-1 BESTIMMUNG IN PLASMAPROBEN DER KLINISCHEN
STUDIE 199
8 STABILITAET VON (+)-CATECHIN, (-)-EPICATECHIN, M1, UND RESVERATROL
UNTER VERSUCHS-BEDINGUNGEN 203
9 STABILITAET DER FLUORESZENZSONDE DAF-2 203
10 ERHOEHUNG DER DAF-2T BILDUNG DURCH ZUSATZ VON NATRIUM-NITRIT/-NITRAT
BEIM EINFRIEREN/AUFTAUEN 204
11 DISPARITAETEN DES NO-ANSPRECHVERMOEGENS BEIM VERGLEICH VERSCHIEDENER
ANALYTISCHER DETEKTIONSSYSTEME 204
12 EINFLUSS EINES NONI-EXTRAKTS AUF DIE FREISETZUNG VON MMP-9 AUS
PRIMAEREN HUMANEN MONOZYTEN 205
E ZUSAMMENFASSUNG 207
F ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 213
G LITERATURVERZEICHNIS 215
16
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