Etablierung eines direkten Kokultur-Modells zur Analyse der Interaktion zwischen mikrovaskulären Endothelzellen und epidermalen Keratinozyten:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Berlin
Mensch-und-Buch-Verl.
2012
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| Beschreibung: | Nebentitel: Establishment of a direct co-culture model for analysis of interactions between microvascular endothelial cells and epidermal keratinocytes |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND ZIEL 7
2 LITERATURUEBERSICHT 9
2.1 DAS VASKULAERE ENDOTHEL 9
2.2 MECHANISMEN DER BLUTGEFAESSBILDUNG 11
2.2.1 VASKULOGENESE UND ANGIOGENESE 11
2.2.1.1 SPROSSUNG 12
2.2.1.2 LUMENBILDUNG 12
2.2.1.3 INTUSSUSZEPTION 14
2.2.2 APOPTOSE 14
2.2.3 VASKULAERE BASALMEMBRAN 15
2.2.4 PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE DIFFERENZIERUNG ANGIOGENER ENDOTHEL-
ZELLEN IN VITRO 15
2.2.5 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE DIFFERENZIERUNG ANGIOGENER
ENDOTHELZELLEN IN VITRO 16
2.3 ALLGEMEINER AUFBAU DER AEUSSEREN BEHAARTEN HAUT 17
2.4 SPEZIELLER AUFBAU DER BOVINEN KLAUENHAUT 18
2.4.1 AUFBAU DER KLAUENEPIDERMIS 18
2.4.1.1 SPEZIELLE STRUKTUR DER KLAUENEPIDERMIS 19
2.4.1.2 STRUKTUR DER KLAUENDERMIS 2 0
2.4.1.3 STRUKTUR DER KLAUENSUBKUTIS 2 0
2.4.2 EXTRAZELLULAERE MATRIX 21
2.4.3 BASALMEMBRAN AN DER DERMO-EPIDERMALEN GRENZFLAECHE 21
2.4.4 KERATINISIERUNG UND VERHORNUNG IN DER KLAUENEPIDERMIS 2 2
2.4.5 PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE DIFFERENZIERUNG VON KERATINOZYTEN IN
VITRO 2 3
2.4.6 ULTRASTRUKTUR DER KERATINOZYTEN IN VITRO 2 3
2.4.7 VASKULAERE VERSORGUNG DER EPIDERMIS 2 4
1
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.5 ZYTOKERATINE ZUM NACHWEIS VON KERATINOZYTEN UND ENDOTHELZELLEN IN
VITRO 2 5
2.6 REGULIERUNG DER ANGIOGENESE 2 6
2.6.1 ANGIOGENE FAKTOREN 2 7
2.6.1.1 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) 2 7
2.7 V E G F IN DER INTERAKTION ZWISCHEN ENDOTHELZELLEN UND KERATINOZYTEN
2 7
2.8 IN VITRO-HAUTKULTURMODELLE 2 9
2.8.1 KOKULTIVIERUNG VON ENDOTHELZELLEN, KERATINOZYTEN UND FIBROBLASTEN
IM DREIDIMENSIONALEN IN VITRO-MODELL 2 9
2.8.2 KOKULTUREN IN FILTEREINSAETZEN 3 4
2.8.2.1 KOKULTIVIERUNG VON ENDOTHELZELLEN, KERATINOZYTEN UND
FIBROBLASTEN IN FILTEREINSAETZEN 3 4
3 MATERIAL 3 7
3.1 ZELLEN 3 7
3.1.1 ENDOTHELZELLEN 3 7
3.1.2 KERATINOZYTEN 3 7
3.2 KULTURMEDIEN 3 8
3.2.1 MEDIEN, MEDIENZUSAETZE UND LOESUNGEN 3 8
3.2.2 VERWENDETE NAEHRMEDIEN 4 0
3.2.3 ZUSAMMENSETZUNG DES SELEKTIVMEDIUMS P 0 4 0
3.2.4 ZUSAMMENSETZUNG DES SELEKTIVMEDIUMS QUANTUM 286 4 0
3.2.5 ZUSAMMENSETZUNG DES ERHALTUNGSMEDIUMS DMEM+ 41
3.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 41
3.4 GERAETE 4 2
3.5 IMMUNZYTOCHEMIE 4 3
3.5.1 PRIMAERANTIKOERPER ZUR MARKIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND
KERATINOZYTEN IN DEN DIREKTEN KOKULTUREN 4 3
2
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.2 IMMUNREAGENZIEN, CHEMIKALIEN 4 4
3.6 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 4 5
3.6.1 VERBRAUCHSMATERIALIEN 45
3.6.2 CHEMIKALIEN 45
4 METHODEN 4 7
4.1 KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN 4 7
4.2 KULTIVIERUNGSGEFAESSE 4 7
4.3 DOKUMENTATION 4 8
4.4 SUBKULTIVIERUNG 4 8
4.5 KRYOKONSERVIERUNG 4 8
4.6 AUFTAUEN DER ZELLKULTUREN 4 8
4.7 ZELLZAEHLUNG 4 9
4.8 KULTIVIERUNGSTECHNIKEN 4 9
4.8.1 PILOTSTUDIE 1: ZELLKULTURPLATTEN-BESCHICHTUNG 4 9
4.8.2 DIREKTE KOKULTIVIERUNG AUF GLASPLAETTCHEN MIT KOLLAGENBESCHICHTUNG
51
4.8.2.1 DIREKTES KOKULTUR-SYSTEM 1 (K+E) 5 2
4.8.2.2 DIREKTES KOKULTUR-SYSTEM 2 (E+K) 5 3
4.8.2.3 DIREKTES KOKULTUR-SYSTEM 3 (SUSPENSION) 5 4
4.8.3 PILOTSTUDIE 2: DIREKTE KOKULTUR IN MILLICELL-FILTEREINSAETZEN 5 4
4.8.4 DIREKTE KOKULTUR IN MILLICELL-PCF-FILTEREINSAETZEN MIT KOLLAGENBE
SCHICHTUNG 5 6
4.8.4.1 DIREKTES MILLICELL-PCF-SYSTEM 1 (K+E) 5 7
4.8.4.2 DIREKTES MILLICELL-PCF-SYSTEM 2 (E+K) 5 8
4.8.4.3 DIREKTES MILLICELL-PCF-SYSTEM 3 (SUSPENSION) 5 9
4.8.5 PILOTSTUDIE 3: INDIREKTE KOKULTIVIERUNG IM MATRIX-MODELL 59
4.8.6 HERSTELLUNG EINER KOLLAGEN-MATRIX 5 9
3
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
4.8.6.1 INDIREKTES MILLICELL-PET-MATRIX-SYSTEM 6 0
4.8.6.2 INDIREKTES MILLICELL-PET-MATRIX-SYSTEM 1 6 2
4.8.6.3 INDIREKTES MILLICELL-PET-MATRIX-SYSTEM 2 6 3
4.8.6.4 INDIREKTES MILLICELL-PET-MATRIX-SYSTEM 3 6 4
4.8.7 KOLLAGEN-KIT-MODELL 65
4.8.7.1 KOLLAGEN-KIT-MODELL 1 6 7
4.8.7.2 KOLLAGEN-KIT-MODELL 2 6 8
4.8.7.3 KOLLAGEN-KIT-MODELL 3 6 9
4.9 PHASENKONTRASTMIKROSKOPIE 71
4.9.1 PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DIREKTEN
KOKULTUREN AUF GLASPLAETTCHEN 71
4.10 IMMUNZYTOCHEMIE 71
4.10.1 IMMUNZYTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DIREKTEN KOKULTUREN AUF
GLASPLAETTCHEN 71
4.11 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE 7 3
4.11.1 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DIREKTEN
KOKULTUREN AUF MILLICELL-PCF-FILTEREINSAETZEN 7 3
5 ERGEBNISSE 7 6
5.1 UNTERSUCHUNG DER MORPHOLOGIE VON ENDOTHELZELLEN UND KERATINOZYTEN
UND DEREN INTERAKTION IM DIREKTEN KOKULTUR-MODELL AUF GLASPLAETTCHEN 7 6
5.1.1 PHASENKONTRASTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG DER DIREKTEN KOKULTUR-
MODELLE AUF GLASPLAETTCHEN 7 6
5.1.1.1 UNTERSUCHUNG DES DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEMS 1 (K+E) 7 6
5.1.1.2 UNTERSUCHUNG D E S DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEMS 2 (E+K) 8 0
5.1.1.3 UNTERSUCHUNG DES DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEMS 3 (SUSPENSION) 8 6
5.2 IMMUNZYTOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN ZUM NACHWEIS VON CK14 UND
C K 1 9 IN KERATINOZYTEN UND ENDOTHELZELLEN IM DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEM
9 0
5.2.1 IMMUNZYTOCHEMISCHE MARKIERUNG MIT ANTI-CK19 IN MIKROVASKULAEREN
ENDOTHELZELLEN IM DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEM 1 (K+E) 91
4
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.1.1 KONTROLLEN 9 3
5.2.2 IMMUNZYTOCHEMISCHE MARKIERUNG MIT ANTI-CK14 IN EPIDERMALEN KERA
TINOZYTEN IM DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEM 2 (E+K) 9 5
5.2.2.1 KONTROLLEN 9 7
5.2.3 IMMUNZYTOCHEMISCHE MARKIERUNG MIT ANTI-CK19 IN MIKROVASKULAEREN
ENDOTHELZELLEN IM DIREKTEN KOKULTUR-SYSTEM 3 (SUSPENSION) 9 8
5.2.3.1 KONTROLLEN 9 9
5.3 HISTOLOGISCHE UNTERSUCHUNG DER DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEME 101
5.3.1 SEMIDUENNSCHNITTE DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 1 (K+E) 101
5.3.2 SEMIDUENNSCHNITTE DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 2 (E+K) 103
5.3.3 SEMIDUENNSCHNITTE DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 3
(SUSPENSION) 105
5.4 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN DER DIREKTEN
KOKULTUREN IN MILLICELL-PCF-FILTEREINSAETZEN 108
5.4.1 ULTRASTRUKTUR DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 1 (K+E) 108
5.4.2 ULTRASTRUKTUR DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 2 (E+K) 113
5.4.3 ULTRASTRUKTUR DES DIREKTEN MILLICELL-PCF-SYSTEMS 3 (SUSPENSION)
118
6 DISKUSSION 125
6.1 GRUNDLAGEN ZUR IN VITRO-KULTIVIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND
KERATINO ZYTEN UND DEREN PRAXISRELEVANZ 126
6.2 ENTWICKLUNG EINES KOKULTUR-MODELLS IN VITRO AUS MIKROVASKULAEREN
ENDO THELZELLEN UND EPIDERMALEN KERATINOZYTEN 128
6.3 ETABLIERUNG EINER METHODIK ZUR KOKULTIVIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND
KERATINOZYTEN IM DIREKTEN MODELL 130
6.4 MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA UND DIFFERENZIERUNG DER EPIDERMALEN
KERATINOZYTEN UND MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN IN DEN DREI DIREKTEN
KOKULTUR-SYSTEMEN 1 (K+E), 2 (E+K) UND 3 (SUSPENSION) AUF GLAS- 132
PLAETTCHEN
6.4.1 ANGIOGENESE-ARTIGE MERKMALE AN MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN IN D
E N KOKULTUR-SYSTEMEN AUF GLASPLAETTCHEN 135
6.5 IMMUNZYTOCHEMISCHE DIFFERENZIERUNG VON ENDOTHELZELLEN UND KERA
TINOZYTEN IN DEN KOKULTUR-SYSTEMEN AUF GLASPLAETTCHEN 137
5
IMAGE 6
INHALTSVERZEICHNIS
6.6 DIREKTE KOKULTUR-SYSTEME IN MILLICELL-PCF-FILTEREINSAETZEN 138
6.7 MORPHOLOGISCHE CHARAKTERISTIKA UND DIFFERENZIERUNG DER EPIDERMALEN
KERATINOZYTEN UND MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN IN DEN DREI DIREKTEN
KOKULTUR-SYSTEMEN 1 (K+E), 2 (E+K) UND 3 (SUSPENSION) IN MILLICELL- 140
PCF-FILTEREINSAETZEN
6.8 DERMO-EPIDERMALE INTERAKTION 144
6.9 ANGIOGENESE-ARTIGE MERKMALE AN MIKROVASKULAEREN ENDOTHELZELLEN IN DEN
KOKULTUR-SYSTEMEN IN MILLICELL-PCF-FILTEREINSAETZEN 144
6.9.1 LUMENBILDUNG IM KOKULTUR-SYSTEM 1 (K+E), KOKULTUR-SYSTEM 2 (E+K)
UND KOKULTUR-SYSTEM 3 (SUSPENSION) IM MILLICELL-PCF-FILTEREINSATZ 145
6.10 EINSATZ DER KOKULTUR-SYSTEME IN DER ERFORSCHUNG DER PATHOMECHANIS-
MEN DER KLAUENREHE UND DER HUFREHE 146
7 ZUSAMMENFASSUNG 149
8 SUMMARV 152
9 ABKUERZUNGEN 154
10 LITERATURVERZEICHNIS 155
11 PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 177
12 DANKSAGUNG 178
13 SELBSTAENDIOKEITSERKLAERUNG 179
6
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