Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 6
SUMMARY 8
1 EINLEITUNG 10
1.1 AUFBAU U N D FUNKTION TRANSKRIPTIONELLER REGULATOREN 10
1.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG VON ARABIDOPSIS
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 11
1.2.1 HOCHDURCHSATZVERFAHREN ZUR GENERIERUNG VON ARABIDOPSIS UEBER
EXPRESSIONSSAMEN-KOLLEKTIONEN 13
1.2.2 METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG UND ANALYSE VON TF-BINDESTELLEN 15
1.2.3 ANALYSE VON CIS-TRANS- WECHSELWIRKUNGEN ZWISCHEN
TRANSKRIPTIONELLEN REGULATOREN UND IHREN ZIEL-PROMOTORSEQUENZEN 16
1.3 FUNKTIONEN TRANSKRIPTIONELLER REGULATOREN IN PFLANZLICHEN
STESSANTWORTEN... 18 1.3.1 TRANSKRIPTIONSKONTROLLE IN DER PFLANZLICHEN
PATHOGENANTWORT 18 1.3.2 TRANSKRIPTIONELLE REGULATOREN PFLANZLICHER
ABWEHRMECHANISMEN GEGENUEBER OXIDATIVEM STRESS 26
1.4 ZIELSETZUNG 28
2 MATERIAL 29
2.1 ORGANISMEN 29
2.1.1 BAKTERIEN 29
2.1.2 PFLANZEN 29
2.2 NUKLEINSAEUREN 29
2.2.1 PLASMIDE 29
2.2.2 OLIGONUKLEOTIDE 30
2.3 GROESSENSTANDARDS 32
2.3.1 DNA-GROESSENSTANDARD 32
2.3.2 PROTEIN-GROESSENSTANDARD 32
2.4 ANTIKOERPER 32
2.5 NAEHRMEDIEN U N D ZUSAETZE 32
2.5.1 BAKTERIENMEDIEN 32
2.5.2 PFLANZENMEDIEN 32
2.5.3 MEDIENZUSAETZE 33
2.5.3.1 ANTIBIOTIKA 33
2.5.3.2 AGAR 33
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS II
2.5.3.3 SONSTIGE ZUSAETZE 33
2.6 LOESUNGEN UND PUFFER 33
2.7 GERAETE 35
2.8 VERBRAUCHSMITTEL 36
2.9 CHEMIKALIEN 36
2.10 ENZYME 37
2.11 KITS 38
3 METHODEN 39
3.1 BAKTERIENANZUCHT UND TRANSFORMATION 39
3.1.1 ANZUCHT VON ESCHERICHIA COLI 39
3.1.2 ANZUCHT VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 39
3.1.3 LAGERUNG DER BAKTERIEN 39
3.1.4 HERSTELLUNG KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI 39
3.1.5 TRANSFORMATION VON ESCHERICHIA COLI 40
3.1.6 HERSTELLUNG KOMPETENTER AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 40
3.1.7 TRANSFORMATION VON AGROBACTERIUM TUMEFACIENS 40
3.2 PFLANZENANZUCHT U N D TRANSFORMATION 41
3.2.1 ANZUCHT VON ARABIDOPSIS THALIANA AUF ERDE 41
3.2.2 STERILE ANZUCHT VON ARABIDOPSIS THALIANA A U F MS-PLATTEN 41
3.2.3 TRANSFORMATION VON ARABIDOPSIS THALIANA MIT HILFE DER
//OWER-T/ZP-METHODE 41
3.2.4 SELEKTION A U F BASTA-RESISTENZ 42
3.2.5 ARABIDOPSIS THALIANA- PROTOPLASTEN-TRANSFORMATION 43
3.2.5.1 ARABIDOPSIS ^A//AA-PROTOPLASTEN-GEWINNUNG 43
3.2.5.2 ARABIDOPSIS F/ZA/ZA/RA-PROTOPLASTEN-PEG-TRANSFORMATION IM
STANDARDVERFAHREN 44
3.2.5.3 ARABIDOPSIS //ZA//AA-PROTOPLASTEN-PEG-TRANSFORMATION IM
HOCHDURCHSATZ-VERFAHREN (PTA-SYSTEM) 4 4
3.2.5.4 MESSUNG DER LUCIFERASE (LUC)-AKTIVITAET 45
3.2.5.5 MESSUNG DER DUALEN LUCIFERASE-AKTIVITAET 45
3.3 EXTRAKTION GENOMISCHER DNA AUS ARABIDOPSIS THALIANA 46
3.4 POLYMERASE-KETTENREAKTION 46
3.4.1 MUTAGENESE-PCR 47
3.5 RESTRIKTIONSSPALTUNG DER DNA 48
3.6 AGAROSEGELELEKTROPHORESE VON DNA-MOLEKUELEN 48
3.7 DNA-ELUTION AUS AGAROSEGELEN 48
3.8 LIGATION 48
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS III
3.9 GATEWAY-REKOMBINATION 49
3.9.1 BP-REAKTION 49
3.9.2 LR-REAKTION 50
3.10 KOLONIE-SCREENING MITTELS PCR 50
3.11 PLASMID-PRAEPARATION MIT HILFE VON KITS 51
3.12 PLASMID-PRAEPARATION MITTELS ALKALISCHER LYSE 51
3.13 DNA-SEQUENZIERUNG 52
3.14 HERSTELLUNG VON PROTEINEXTRAKTEN AUS TRANSFORMIERTEN ARABIDOPSIS
PROTOPLASTEN 52
3.15 WESTERN BLOT ANALYSE 52
3.15.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 52
3.15.2 PROTEINTRANSFER AUF EINE PVDF-MEMBRAN 53
3.15.3 IMMUNODETEKTION MIT DEM ECL+ SYSTEM 54
3.16 VERWENDETE COMPUTERPROGRAMME 54
4 ERGEBNISSE 55
4.1 DAS PTA-SYSTEM: ANWENDUNG EINES HOCHDURCHSATZVERFAHRENS F UE R
PROTOPLASTEN-TRANSFORMATIONEN ZUR FUNKTIONELLEN ANALYSE DES ARABIDOPSIS
THALIANA TRANSKRIPTIONSFAKTOR-ORFEOMS 55
4.1.1.1 ETABLIERUNG EINES PROTOPLASTENTRANSFORMATIONSSYSTEMS FUER
MIKROTITERPLATTEN 58
4.1.1.2 VERGLEICH MOEGLICHER DETEKTIONSMETHODEN ZUR LUMINESZENZ-MESSUNG .
59
4.1.1.3 EVALUIERUNG VERSCHIEDENER PRAEPARATIONSMETHODEN ZUR GEWINNUNG
HOCHREINER PLASMID-DNA ZUR PROTOPLASTENTRANSFORMATION 61 4.1.1.4
ANPASSUNG DER ERFORDERLICHEN DNA-MENGEN AN DAS HOCHDURCHSATZVERFAHREN 62
4.1.1.5 DETEKTION DER IN PROTOPLASTEN EXPRIMIERTEN FUSIONSPROTEINE 63
4.1.1.6 REPRODUZIERBARKEIT DER IM PTA-SYSTEM ERHALTENEN
TRANSAKTIVIERUNGSDATEN 64
4.1.1.7 DIE TRANSAKTIVIERBARKEIT VON REPORTERKONSTRUKTEN MIT HOHER
GRUNDAKTIVITAET 66
4.1.1.8 UEBERPRUEFUNG DES PTA-KONZEPTES ANHAND EINER
TRANSAKTIVIERUNGSSTUDIE DER BEREITS BEKANNTEN PROMOTOREN VON P D F 1.2
UND RD29A MIT DER AP2/ERF-TF-FAMILIE 69
4.1.1.9 GENERIERUNG EINER TF-UEBEREXPRESSIONSBANK MIT HILFE DER
GATEWAYTECHNOLOGIE 71
4.1.2 ANWENDUNGSMOEGLICHKEITEN DES PTA-SYSTEMS ZUR FUNKTIONELLEN
CHARAKTERISIERUNG VON ARABIDOPSIS TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 71 4.1.2.1
DETEKTION VON REPRESSOREIGENSCHAFTEN 71
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.1.2.2 INDUKTION DER PROMOTORAKTIVITAET DURCH VERSCHIEDENE
STRESS-STIMULI ..73
4.1.2.3 ANALYSE VON PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONEN MIT HILFE DES
PTA-SYSTEMS 77
4.1.2.4 ANALYSE DES EINFLUSSES VON SIGNAL-MOLEKUELEN A U F DIE AKTIVITAET
VON TF 78
4.1.3 ANWENDUNG DES PTA-SYSTEMS IN VERSCHIEDENEN SCREENING- ANSAETZEN 80
4.1.3.1 ANALYSE ZUM EINFLUSS VON BZIP TRANSKRIPTIONSFAKTOREN A U F DIE
AUXINVERMITTELTE INDUKTION DES G//3.5-PROMOTORS 80
4.1.3.2 IDENTIFIZIERUNG VON TRANSKRIPTIONEILEN REGULATOREN DES
ARABIDOPSIS THALIANA SEKUNDAERSTOFFWECHSELS ZUR SYNTHESE VON
TRYPTOPHANABGELEITETEN SEKUNDAERMETABOLITEN 84
4.1.3.2.1 SCREENING DER TF-EXPRESSIONSVEKTOR-KOLLEKTION AUF
TRANSAKTIVIERUNG VON PROMOTOREN AUSGEWAEHLTER GENE DES
SEKUNDAERSTOFFWECHSELS ZUR SYNTHESE VON TRYPTOPHAN UND ABGELEITETEN
SEKUNDAERMETABOLITEN 86
4.1.3.2.2 DER EINFLUSS DER EAR-DOMAENE VON ATERF#079 A U F DIE
AKTIVIERUNG DES CYP71A12- PROMOTORS 95
4.1.3.2.3 IDENTIFIZIERUNG REPRESSIVER REGULATOREN DER
CTIV/^/I-EXPRESSION 97
4.2 ATTORF-EX-BANK: SCREENING EINER ARABIDOPSIS THALIANA
UEBEREXPRESSIONSSAMENBANK A U F ERHOEHTE RESISTENZ GEGENUEBER OXIDATIVEM
STRESS 99
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG VON UEBEREXPRESSIONSPFLANZEN DIE EINE ERHOEHTE
RESISTENZ GEGENUEBER OXIDATIVEM STRESS ZEIGEN 100
4.2.2 ANALYSE VON BZIPL GAIN OFFUNCTION- UND LOSS OFFUNCTION- LINIEN 102
DISKUSSION 105
5.1 DAS PTA-SYSTEM IST EINE GEEIGNETE SCREENING-PLATTFORM ZUR
IDENTIFIZIERUNG AKTIVIERENDER ARABIDOPSIS TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 105
5.2 IN DER ANWENDUNG BIETET DAS PTA-SYSTEM ERHEBLICHE VORTEILE GEGENUEBER
ANDEREN METHODEN 108
5.3 MIT HILFE DES PTA-SYSTEMS LASSEN SICH POTENTIELLE REGULATOREN
PFLANZLICHER STRESS ANTWORTEN IDENTIFIZIEREN 112
5.3.1 DIE AUXIN-VERMITTELTE EXPRESSION DES GH3.3- GENS KANN DURCH VIELE
TRANSKRIPTIONSFAKTOREN DER BZIP-FAMILIE GESTEIGERT WERDEN 113 5.3.2 MIT
HILFE DES PTA-SYSTEMS KONNTEN POTENTIELLE REGULATOREN DER
BIOSYNTHESEWEGE VON TRYPTOPHAN, INDOL-GLUKOSINOLATEN UND CAMALEXIN
IDENTIFIZIERT WERDEN 115
5.4 DURCHMUSTERUNG DER A T T ORF-EX-BANK: UEBEREXPRESSIONSLINIEN F UE R
DIE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN BZIPL U N D OBP1 ZEIGEN EINE ERHOEHTE TOLERANZ
GEGENUEBER OXIDATIVEN STRESS 126
IMAGE 5
INHALTSVERZEICHNIS V
6 LITERATURVERZEICHNIS 129
7 ANHANG 144
7.1 GRUNDAKTIVITAETEN DER PROMOTOR:LUC-KONSTRUKTE VON AUSGEWAEHLTEN GENE
DER BIOSYNTHESE VON TRYPTOPHAN, INDOL-GLUKOSINOLATEN UND CAMALEXIN 144
7.2 EINFLUSS DER EAR-ERF-TF A U F DIE CYP71 A I 3-PROMOTOR-AKTIVITAET 145
7.3 WEITERE ERGEBNISSE DES PTA-SCREENINGS DES CYP7LA12-PROMOTORS 146
7.4 PROMOTOR-BINDESTELLEN DER GENE CYP71A12, CYP71A13, WRKY40, WRKY18 U
N D WRKY10 151
7.5 PTA-EXPRESSIONSVEKTOR-KOLLEKTION 157
7.6 KOLLEKTION AD- UND BD-FUSIONIERTER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN 175
7.7 WEITERE EGEBNISSE AUS DEM SCREENING DER ATTORF-EX-BANK 176
8 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 177
8.1 ALLGEMEINE ABKUERZUNGEN 177
8.2 EINHEITEN 179
8.3 PRAEFIXE 179
8.4 AMINOSAEUREN 179
8.5 NUKLEOTIDE 179
9 DANKSAGUNG 180
10 LEBENSLAUF 181
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| spelling | Wehner, Nora 2012- Verfasser (DE-588)1024537072 aut Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms von Nora Wehner Establishment and application of molecular tools to analyse the Arabidopsis thaliana transcription factor ORFeome 2012 V, 179 Bl. Ill. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Würzburg, Univ., Diss., 2012 High throughput screening (DE-588)4596131-1 gnd rswk-swf Ackerschmalwand (DE-588)4141299-0 gnd rswk-swf Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 gnd rswk-swf Protoplast (DE-588)4047556-6 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Ackerschmalwand (DE-588)4141299-0 s Transkriptionsfaktor (DE-588)4303350-7 s Protoplast (DE-588)4047556-6 s High throughput screening (DE-588)4596131-1 s DE-604 Erscheint auch als Online-Ausgabe urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057 https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057 Resolving-System kostenfrei Volltext DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=025185198&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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