Untersuchungen von Konformationsänderungen einzelner Membranproteine mittels Förster-Resonanz-Energie-Transfer:
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2012
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 6
SUMMARY 8
1 EINLEITUNG 16
2 PHYSIKALISCHE GRUNDLAGEN 2 4
2. T GRUNDLAGEN D E R PHOTOPHYSIK V O N FLUOROPHOREN 2 4
2.2 FLUORESZENZ R E S O N A N Z ENERGIE T R A N S F E R ( F R E T ) 2 9
2.3 FLUORESZENZ ANISOTROPIE 3 3
2.4 FLUORESCENCE CORRELATION SPECTROSCOPY ( F C S ) 3 5
2.5 KONFOKALES-EINZELMOLEKUEL-MIKROSKOPIE-SETUP 3 7
2.6 DUTY CYCLE O P T I M I Z E D ALTERNATING LASER EXCITATION 4 2
2.7 BURST ANALYZER 4 4
2.8 HIDDEN M A R K O V M O D E L L E FUER DIE EINZELMOLEKUELANALYSE 4 6
3 BIOCHEMISCHE METHODEN 52
3.1 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 5 3
3.1.1 PROTEINBESTIMMUNG M I T B C A 5 3
3.1.2 AMIDOSCHVVARZ 5 4
3.2 SELEKTIVE FLUORESZENZMARKIERUNG 5 4
3.2.1 DURCHFUEHRUNG 5 5
3.2.2 MARKIERUNGSGRADBESTIMMUNG 5 7
3.3 AKTIVITAETSMESSUNGEN V O N M E M B R A N P R O T E I N E N 5 8
3.3.1 M E S S U N G D E R A T P - H Y D R O L Y S E 5 8
3.3.2 SYNTHESETEST 6 1
3.4 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE ( S D S - P A G E ) 6 4
3.4.1 G E L Z U S A M M E N S E T Z U N G 6 4
3.4.2 PROBENVORBEREITUNG 6 6
3.4.3 A N F AE R B U N G D E R G E L B A N D E N MITTELS C O O M A S S I
E 6 7
3.4.4 VISUALISIERUNG SPEZIFISCH FLUORESZENZMARKIERTER PROTEINBANDEN 6 8
3.5 HERSTELLUNG V O N PROTEOLIPOSOMEN 6 8
3.5.1 LIPOSOMENHERSTELLUNG U N D REKONSTITUTION FUER P O COAT U N D Y I D
C 6 9
3.5.2 LIPOSOMENHERSTELLUNG U N D REKONSTITUTION FUER D E N A B C - T R A
N S P O R T E R P G P 7 0
3.5.3 LIPOSOMENHERSTELLUNG U N D REKONSTITUTION FUER DIE
FOFI-ATP-SYNTHASE 71
4
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
4 MEMBRANSINSERTION DES PHAGENPROTEINS PF3 COAT DURCH YIDC 74
4.1 PROBENPRAEPARATION 8 3
4.1.1 R E I N I G U N G U N D FLUORESZENZNIARKIERUNG V O N Y I D C 8 3
4.1.2 R E I N I G U N G U N D FLUORESZENZMARKIERUNG V O N PF3 C O A T
PROTEIN 8 5
4.2 MESSPRINZIP 8 7
4.3 ERGEBNISSE 9 0
4.3.1 F C S - A N A L Y S E D E R INSERTION V O N P D COAT PROTEIN IN
YIDC-PROTEOLIPOSOMEN 9 0
4.3.2 U N T E R S U C H U N G D E S INSERTIONSVERHALTENS V O N PF3 C O A
T PROTEIN MITTELS D Y N A M I S C H E M Q U E N C H E N 9 3
4.3.3 ZEITLICHE A U F L OE S U N G D E S INSERTIONSVORGANGS V O N PF3
COAT PROTEIN IN Y I D C PROTEOLIPOSOMEN MITTELS F R E T 103
4.3.4 TEMPERARTURABHAENGIGKEIT D E R INSERTION V O N PF3 IN
YIDC-PROTEOLIPOSOMEN.... 113
4.4 DISKUSSION D E R ERGEBNISSE 116
5 DER TRANSPORTNIECHANISMUS VON PGP 122
5.1 PROBENPRAEPARATION 126
5.2 MESSPRINZIP 129
5.3 MANUELLE A U S W E R T U N G D E R EINZELMOLEKUELSPUREN 130
5.4 A U S W E R T U N G D E R EINZELMOLEKUELSPUREN M I T
HIDDEN-MARKOV-MODELLEN 136
5.5 DISKUSSION U N D Z U S A M M E N F A S S U N G D E R ERGEBNISSE 143
6 ELASTISCHE DEFORMATIONEN DER F 0FI-ATP-SYNTHASE 148
6.1 PROBENPRAEPARATION 151
6.2 MESSPRINZIP 154
6.3 ERGEBNISSE 155
6.3.1 ROTATION D E R UNTEREINHEITEN E U N D C 155
6.3.2 ELASTISCHE ENERGIESPEICHERUNG ZWISCHEN E U N D C 160
6.3.3 HYDROLYSE 161
6.3.4 SYNTHESE 169
6.4 DISKUSSION U N D Z U S A M M E N F A S S U N G D E R ERGEBNISSE 173
7 DISKUSSION 176
8 ZUSAMMENFASSUNG 178
ANHANG 183
LITERATURVERZEICHNIS 192
5
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