Signaltransduktion in Corynebacterium glutamicum: Studien zur Rolle von Proteinen mit einer FHA-Domäne
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| Language: | German |
| Published: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich
2012
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| Series: | Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Gesundheit ; Bd. 49 |
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN 8
1 ABSTRACT 11
2 ZUSAMMENFASSUNG 12
3 EINLEITUNG 13
3.1 SIGNALTRANSDUKTION DURCH SERIN/THREONIN-PROTEINKINASEN IN
CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 13
3.2 ROLLE DER FHA-DOMAENEN-PROTEINE IN C. GLUTAMICUM 15
3.3 POSTTRANSLATIONALE REGULATION DES ODH-KOMPLEXES IN C. GLUTAMICUM 18
4 MATERIAL UND METHODEN 23
4.1 PUFFERLOESUNGEN UND ANDERE STAMMLOESUNGEN 23
4.2 NAEHRMEDIEN 24
4.3 OLIGONUKLEOTIDE 25
4.4 BAKTERIENSTAEMME 26
4.5 PLASMIDE 27
4.5.1 KONSTRUKTION VON PJC1-DERIVATEN 29
4.5.2 KONSTRUKTION VON PET-TEV-DERIVATEN 29
4.5.3 KONSTRUKTION VON PAN6-DERIVATEN 30
4.5.4 KONSTRUKTION DES PLASMIDS PEKEX2-FF7A/ SS 31
4.6 STAMMHALTUNG VON BAKTERIENSTAEMMEN 31
4.7 KULTIVIERUNG VON C. GLUTAMICUM 31
4.7.1 KULTIVIERUNG VON C. GLUTAMICUM ZUR PROTEINUEBERPRODUKTION 31
4.7.2 KULTIVIERUNG VON C. GLUTAMICUM ZUR UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON
GLUTAMIN AUF DEN PHOSPHORYLIERUNGSSTATUS VON ODHL 32
4.8 KULTIVIERUNG VON . COLI 32
4.8.1 KULTIVIERUNG VON E. COLI ZUR PROTEINUEBERPRODUKTION 33
4.9 BESTIMMUNG DES WACHSTUMS VON BAKTERIEN 33
4.10 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 33
4.10.1 ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA 33
4.10.2 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 34
4.10.3 DNA-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 34
4.10.4 DNA-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 34
4.10.5 REKOMBINANTE DNA-TECHNIKEN 34
4.10.6 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER E. COLI- ZELLEN 35
4.10.7 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER C. GLUTAMICUM- ZELLEN
36
4.10.8 POLYMERASEKETTENREAKTION 36
4.10.9 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE 37
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IMAGE 2
6
4.10.10 DNA-SEQUENZANALYSE 38
4.11 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 38
4.11.1 ZELLAUFSCHLUSS, ZELLFRAKTIONIERUNG UND SOLUBILISIERUNG VON
PROTEINEN AUS ZELLMEMBRANEN 38
4.11.2 PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG 39
4.11.3 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS NI 2+- NITRILOTRIESSIGSAEURE
(NTA)-AGAROSE..40
4.11.4 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE MITTELS SFREPTACTIN- SEPHAROSE 40
4.11.5 PUFFERAUSTAUSCH DURCH GELFILTRATION MITTELS PD-10- SAEULCHEN 41
4.11.6 KONZENTRIERUNG VON PROTEINLOESUNGEN 41
4.11.7 GROESSENAUSSCHLUSSCHROMATOGRAPHIE 41
4.11.8 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE 41
4.11.9 WESTERN-BLOT 42
4.11.10 N-TERMINALE PROTEINSEQUENZIERUNG 43
4.11.11 MALDI-TOF-MASSENSPEKTROMETRIE 4 3
4.11.12 OBERFLAECHENPLASMONRESONANZ (SPR)-T ECHNIK 4 4
4.12 MIKROSKOPISCHE METHODEN 45
4.12.1 PHASENKONTRAST-MIKROSKOPIE 45
4.13 HPLC-METHODEN 46
4.13.1 BESTIMMUNG VON GLUCOSE UND ORGANISCHEN SAEUREN 4 6
4.13.2 BESTIMMUNG VON AMINOSAEUREN 46
5 ERGEBNISSE 47
5.1 CHARAKTERISIERUNG DER INTERAKTION ZWISCHEN DER
ODH-KOMPLEX-UNTEREINHEIT ODHA UND DEM FHA-DOMAENEN-PROTEIN ODHL 47
5.1.1 EINGRENZUNG INTERAGIERENDER PROTEINDOMAENEN IN ODHA MITTELS
KOREINIGUNGSEXPERIMENTEN 47
5.1.2 EINGRENZUNG INTERAGIERENDER PROTEINDOMAENEN IN ODHL MITTELS
KOREINIGUNGSEXPERIMENTEN 50
5.1.3 EINGRENZUNG INTERAGIERENDER PROTEINDOMAENEN MITTELS SPR-TECHNIK 51
5.2 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON GLUTAMIN AUF DEN
ODHL-PHOSPHORYLIERUNGSSTATUS 55
5.3 WACHSTUMSANALYSE VON C. GLUTAMICUM AODHL 57
5.3.1 KOMPLEMENTATION DER ODHL- DELETION 59
5.4 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER PROTEINE FHAA UND FHAB 61
5.4.1 BIOINFORMATISCHE ANALYSE DER DOMAENENSTRUKTUR VON FHAA UND FHAB 61
5.4.2 BESTIMMUNG DES NATIVEN TRANSLATIONSSTARTS VON FHAA 62
5.4.3 ANALYSE DER LOKALISATION VON FHAB 63
5.4.4 UEBERPRODUKTION, REINIGUNG UND BESTIMMUNG DER NATIVEN MOLEKULAREN
MASSE VON FHAA UND FHAB 64
5.4.5 BESTIMMUNG VON PHOSPHORYLIERUNGSSTELLEN IN FHAA UND FHAB 68
5.4.6 FUNKTIONALE UNTERSUCHUNG VON FHAA 70
5.5 CHARAKTERISIERUNG DER STAEMME C. GLUTAMICUM AFHAA UND A FHAB 72
5.5.1 WACHSTUMSANALYSE VON C. GLUTAMICUM AFHAA UND AFHAB 72
5.5.2 KOMPLEMENTATION DER FHAA- UND FF?ASS-DELETION 76
5.5.3 UNTERSUCHUNG DER ZELLMORPHOLOGIE VON C. GLUTAMICUM AFHAA UND AFHAB
77
5.6 IDENTIFIZIERUNG VON INTERAKTIONSPARTNERN VON FHAA UND FHAB 79
5.6.1 KOREINIGUNGSEXPERIMENTE MIT FHAA UND FHAB 79
IMAGE 3
7
6 DISKUSSION 81
6.1 CHARAKTERISIERUNG DER ODHA-ODHL-INTERAKTION 81
6.2 UNTERSUCHUNGEN ZUR PHYSIOLOGISCHEN FUNKTION VON ODHL IN C.
GLUTAMICUM 82
6.3 BIOCHEMISCHE EIGENSCHAFTEN VON FHAA UND FHAB 86
6.4 FUNKTION VON FHAA UND FHAB IN C. GLUTAMICUM 89
LITERATURVERZEICHNIS 93
ANHANG 104
|
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