Die Untersuchung der Immunpathogenese im Mausmodell der Antigen- / Kollagen-induzierten Arthritis: (ACIA)
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Berlin
2011
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
SUMMARY V
ZUSAMMENFASSUNG VII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS IX
1 EINLEITUNG 1
1.1 AUTOIMMUNITAET 1
1.1.1 R H E U M A T O I D E A R T H R I T I S 3
1.1.2 A R T H R I T I S - T I E R M O D E L L E 6
1.1.2.1 ANTIGEN-INDUZIERTE ARTHRITIS (AIA) 7
1.1.2.2 KOLLAGEN-INDUZIERTE ARTHRITIS (CIA] 8
1.2 T-ZELLEN IN RA 9
1.3 ENTZUENDUNG UND SCHMERZ 1 2
1.3.1 DAS N O Z I Z E P T I V E S Y S T E M 1 2
1.3.2 S C H M E R Z K O M P O N E N T E N 1 4
1.3.3 A K U T E R U N D C H R O N I S C H E R S C H M E R Z 1 5
1.3.4 EIN T R A N S G E N E S T I E R M O D E L L F UE R D I E U N T E R
S U C H U N G V O N E N T Z UE N D U N G S S C H M E R Z 1 6
1.4 ZIEL DER ARBEIT 1 8
2 MATERIAL UND METHODEN 19
2.1 MATERIAL 1 9
2.1.1 M AE U S E 1 9
2.1.2 ZELLLINIEN 1 9
2.1.3 B A K T E R I E N 1 9
2.1.4 P L A S M I D E 1 9
2.1.5 OLIGONUKLEOTIDE 1 9
2.1.6 E N Z Y M E 2 0
2.1.7 A N T I K OE R P E R F UE R E N Z Y M E - L I N K E D I M M U N O S
O R B E N T A S S A Y S (ELISA) 2 0
2.1.8 A N T I K OE R P E R , LEKTINE U N D S T R E P T A V I D I N - K O
N J U G A T E 2 1
2.1.9 CHEMIKALIEN U N D P R O T E I N E 2 2
2.1.10 G E R AE T E U N D S O N S T I G E V E R B R A U C H S M A T E R I
A L I E N 2 3
2.1.11 S O F T W A R E P R O G R A M M E 2 7
2.2 METHODEN 2 8
2.2.1 K U L T U R V O N B A K T E R I E N 2 8
2.2.1.1 FLUESSIGKULTUREN 28
I
HTTP://D-NB.INFO/1026504295
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.1.2 PLATTENKULTUREN 28
2.2.1.3 LAGERUNG U N D REAKTIVIERUNG VON BAKTERIENKULTUREN 2 8
2.2.2 K U L T U R V O N S AE U G E T I E R Z E L L E N 2 8
2.2.2.1 KULTUR U N D LAGERUNG VON SAEUGETIERZELLEN 2 8
2.2.3 Z E L L Z A H L B E S T I M M U N G 2 9
2.2.4 P R AE P A R A T I O N U N D A N A L Y S E V O N DNA 2 9
2.2.4.1 AMPLIFIKATION VON DNA MITTELS D E R POLYMERASEN KETTENREAKTION
(PCR) 29
2.2.4.2 TRENNUNG VON DNA-FRAGMENTEN DURCH AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 30
2.2.4.3 ISOLATION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 30
2.2.4.4 REINIGUNG VON DNA AUS WAESSRIGEN LOESUNGEN 30
2.2.4.5 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 3 1
2.2.4.6 ISOLIERUNG VON BAC-DNA MITTELS
CAESIUMCHLORID-DICHTEZENTRIFUGATION 32
2.2.4.6.1 BAC-PRAEPARATION FUER CAESIUMCHLORIDDICHTEZENTRIFUGATION 32
2.2.4.6.2 CAESIUMCHLORID-DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION 32
2.2.4.6.3 ISOLIERUNG D E R BAC-DNA AUS DEM CAESIUMCHLORIDGRADIENTEN 32
2.2.4.7 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA 33
2.2.4.8 SEQUENZIERUNG VON DNA 3 3
2.2.5 K L O N I E R U N G V O N DNA 3 3
2.2.5.1 SPALTUNG VON DNA DURCH RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN 3 3
2.2.5.2 LIGATION VON DNA-FRAGMENTEN DURCH HOMOLOGE REKOMBINATION 33
2.2.5.3 TRANSFORMATION 3 4
2.2.5.3.1 HERSTELLUNG ELEKTROKOMPETENTER BAKTERIEN UND ELEKTROPORATION 3
4
2.2.5.3.2 HERSTELLUNG CACH-KOMPETENTER BAKTERIEN U N D HITZESCHOCK 3 5
2.2.5.4 TRANSFEKTION VON HEK293 ZELLEN DURCH LIPOFEKTAMIN 3 5
2.2.5.5 LUCIFERASE-ASSAY 3 5
2.2.5.6 DELETION VON ANTIBIOTIK ARESISTENZEN DURCH
FLIPPASE-REKOMBINATION 36
2.2.6 D U R C H F L U S S Z Y T O M E T R I E 3 6
2.2.6.1 FAERBUNG INTRAZELLULAERER MOLEKUELE 3 7
2.2.7 T I E R E X P E R I M E N T E 3 7
2.2.7.1 UNTERBRINGUNG D E R TIERE 3 7
2.2.7.2 ARTHRITIS-MODELL: ANTIGEN-/ KOLLAGEN-INDUZIERTE ARTHRITIS (ACIA)
38
2.2.7.3 ZEITVERLAUF D E R ACIA 38
2.2.7.4 TEST D E R MOTORISCHEN LEISTUNGSFAEHIGKEIT AUF DEM LAUFBAND (ROTA
ROD) 38
2.2.7.5 DEPLETION VON CD8+ T-ZELLEN 39
2.2.7.6 BEURTEILUNG D E R ARTHRITIS 39
2.2.7.6.1 AUTOANTIKOERPER 39
2.2.7.6.2 HISTOLOGISCHE EVALUATION (SCORING) 39
2.2.7.6.3 VERGLEICH D E R IN DEN KNIESPALT EINGEWANDERTEN ZELLEN 4 0
2.2.7.7 PRAEPARATION VON SERUM 4 0
2.2.8 I M M U N G L O B U L I N - U N D Z Y T O K I N B E S T I M M U N
G E N M I T T E L S ELISA 4 1
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.9 L Y M P H O Z Y T E N P R AE P A R A T I O N A U S BLUT, D E R MILZ
U N D L Y M P H K N O T E N 4 2
2.2.9.1 PRAEPARATION VON ZELLEN AUS DEM KNIEGELENK MITTELS SYNOVIALLAVAGE
42
2.2.10 I N T R A A R T I K U L AE R E R T R A N S F E R V O N B I O T I N
Y L I E R T E N MILZZELLEN 4 3
2.2.11 UNSPEZIFISCHE S T I M U L A T I O N M I T I O N O M Y C I N U N D
PMA 4 3
2.2.12 A N T I G E N S P E Z I F I S C H E S T I M U L A T I O N U N D P
R O L I F E R A T I O N 4 3
2.2.13 HISTOLOGIE 4 4
2.2.13.1 PRAEPARATION VON ORGANEN U N D KNIEGELENKEN FUER PARAFFINSCHNITTE
4 4
2.2.13.2 PRAEPARATION VON ORGANEN UND KNIEGELENKEN FUER GEFRIERSCHNITTE 4
4
2.2.13.3 HAEMATOXYLIN-EOSIN-FAERBUNG 4 5
2.2.13.4 MAY-GRUENWALD-GIEMSA-FAERBUNG 4 5
2.2.13.5 IMMUNHISTOCHEMIE 4 5
2.2.13.5.1 DEMASKIERUNG D E R PARAFFINSCHNITTE 4 6
2.2.13.5.2 CHROMOGENE IMMUNHISTOCHEMIE 4 6
2.2.14 STATISTISCHE D A T E N A N A L Y S E 4 7
3 ERGEBNISSE 4 8
3.1 DAS MODELL DER ANTIGEN- / KOLLAGEN-INDUZIERTEN ARTHRITIS (ACIA) 4 8
3.1.1 P A T H O G E N E S E D E R ACIA I N D E N M A U S S T AE M M E N
BALB/C U N D C 5 7 B L / 6 4 9
3.1.1.1 GELENKMORPHOLOGIE 4 9
3.1.1.2 BILDUNG ARTHRITIS-SPEZIFISCHER AUTOANTIKOERPER 5 1
3.1.1.3 ZELLULAERE ZUSAMMENSETZUNG D E R SYNOVIALFLUESSIGKEIT IM
KNIEGELENK ...55
3.1.1.4 ZYTOKINPRODUKTION NACH LYMPHOZYTENSTIMULATION 58
3.1.2 E R S T M A L I G E B E S C H R E I B U N G D E S P E R I A R T I
K U L AE R E R L Y M P H K N O T E N I N BALB/C
M AE U S E N 6 0
3.2 DIE ROLLE VON T-ZELL-SUBPOPULATIONEN IM ACIA-MODELL 6 4
3.2.1 ZYTOTOXISCHE T-ZELLEN (CTLS) 6 4
3.2.1.1 DEPLETION D E R CTLS 6 4
3.2.1.2 PATHOGENESE D E R ACIA IN CTL-DEPLETIERTEN TIEREN 66
3.2.1.2.1 GELENKMORPHOLOGIE 6 6
3.2.1.2.2 BILDUNG ARTHRITIS-SPEZIFISCHER AUTOANTIKOERPER 6 7
3.2.1.2.3 ZYTOKINSPIEGEL IM SERUM 6 7
3.2.2 TFH-ZELLEN 6 8
3.2.2.1 TFH-REPORTERMAUS 69
3.2.2.2 AUSWAHL DES PASSENDEN BAC-KLONS 6 9
3.2.2.3 DIE REPORTERGENKASSETTE 70
3.2.2.4 REKOMBINATION D E R REPORTERKASSETTE MIT 1L-21 HOMOLOGIEREGIONEN
7 1
3.2.2.5 SCREENING D E R REKOMBINIERTEN KLONE 73
3.2.2.6 AUSSCHNEIDEN D E R IL-21-FLANKIERTEN REPORTERKASSETTE 74
3.2.2.7 REKOMBINATION DER REPORTERGENKASSETTE IN DEN IL-21 BAC-KLON 74
3.2.2.8 ENTFERNUNG D E R AMPIZILLINRESISTENZ 75
II I
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.9 LINEARISIERUNG U N D INJEKTION IN BEFRUCHTETE OOZYTEN 7 5
3.3 ENTZUENDUNG UND SCHMERZ 7 5
3.3.1 I M M U N O L O G I S C H E C H A R A K T E R I S I E R U N G D E
R M V I I A - T R A N S G E N E N M AE U S E 7 6
3.3.1.1 ABWESENHEIT VON AUTOANTIKOERPERN GEGEN DAS MVIIA-TOXIN 76
3.3.1.2 UNVERAENDERTE ORGANSTRUKTUR UNBEHANDELTER MVIIA-TRANSGENER TIERE
7 6
3.3.2 P A T H O G E N E S E D E R ACIA IN M V I I A - T R A N S G E N E
N T I E R E N 7 9
3.3.2.1 ORGANVERGLEICH VON ARTHRITISCHEN WILDTYP- U N D MVIIA-MAEUSEN 79
3.3.2.2 IMMUNGLOBULINSUBKLASSEN VON ARTHRITISCHEN WT- U N D MVIIA-MAEUSEN
8 1
3.3.2.3 BILDUNG ARTHRITIS-SPEZIFISCHER AUTOANTIKOERPER 8 1
3.3.2.4 ZYTOKINSEKRETION VON LYMPHKNOTENZELLEN 8 2
3.3.2.5 MOTORISCHE KOORDINATION U N D LEISTUNGSFAEHIGKEIT 8 3
4 DISKUSSION 8 4
4.1 DAS ACIA-MODELL 8 5
4.1.1 A R T H R I T I S - I N D U K T I O N I M ACIA-MODELL 8 6
4.1.2 VERGLEICH D E R ACIA-AUSPRAEGUNG B E I BALB/C U N D C 5 7 B L / 6 M
AE U S E N 8 8
4.1.3 D E R P E R I A R T I K U L AE R E L Y M P H K N O T E N IN BALB/C
- M AE U S E N 9 0
4.2 DIE ROLLE VON T-ZELLEN IN RHEUMATOIDER ARTHRITIS UND ACIA 9 1
4.2.1 ZYTOTOXISCHE T - L Y M P H O Z Y T E N (CTLS) 9 3
4.2.2 TFH-ZELLEN U N D D I E IL-21 R E P O R T E R M A U S 9 5
4.3 ENTZUENDUNG UND SCHMERZ 9 6
LITERATURVERZEICHNIS 100
PUBLIKATIONSLISTE 116
DANKSAGUNG 117
ERKLAERUNG 118
IV
|
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