Elektrophysiologische Charakterisierung struktureller Modifikationen der Agonistbindungsstelle rekombinanter hP2X-Rezeptoren:
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|---|---|
| adam_text | 1.
EINLEITUNG
...........................................................................................................
7
1.1.
S
CHMERZ
...........................................................................................................
7
1.2.
THERAPEUTISCHE
ANSAETZE
.......................................................................................................
8
1.3.
D
IE
PHYSIOLOGISCHE
UND
PATHOPHYSIOLOGISCHE
B
EDEUTUNG
DER
P2-R
EZEPTOREN
...........................................................................................................
9
1.3.1.
DIE
PURINERGEN
REZEPTOREN
.........................................................................
9
1.3.2.
P2Y-REZEPTOREN
.........................................................................................
10
1.3.3.
P2X-REZEPTOREN
.........................................................................................
11
1.3.4.
DIE
BETEILIGUNG
DES
P2X3
UND
DES
P2X2/3-REZEPTOREN
AM
SCHMERZ
.....
14
1.3.5.
STRUKTURELLE
UND
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DES
P2X3-REZEPTORS
............
16
1.3.6.
STRUKTURELLE
UND
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DES
HETEROTRIMEREN
P2X2/3
REZEPTORS...............................................................................................................
20
1.3.7.
STRUKTURELLE
UND
FUNKTIONELLE
EIGENSCHAFTEN
DER
P2X6-UNTEREINHEIT
...........
21
1.4.
A
UFGABENSTELLUNG
UND
Z
IELSETZUNG
.............................................................
22
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
..............................................................................
23
2.1.
G
ERAETE
............................................................................................................
23
2.2.
V
ERBRAUCHSMATERIALIEN
.................................................................................
24
2.3.
C
HEMIKALIEN
.....................................................................................................
25
2.4.
C
HEMIKALIENZUSAMMENSETZUNGEN
(K
ITS
)
........................................................
27
2.5.
M
EDIEN
UND
P
UFFER
..........................................................................................
27
2.6.
H
ERSTELLUNG
DER
H
P2X2
A
-
UND
H
P2X6-P
LASMIDE
...........................................
28
2.6.1.
KLONIERUNG
DER
WILDTYPPLASMIDE
.................................................................
28
2.6.2.
TRANSFORMATION
UND
PLASMIDPRAEPARATION
....................................................
31
2.6.3.
BESEITIGUNG
DES
HIS-TAG
AUS
DEM
P2X6-WILDTYPPLASMID............................
32
2.7.
H
ERSTELLUNG
DER
K
ONKATEMERE
.....................................................................
32
2.8.
M
UTAGENESE
....................................................................................................
36
2.9.
Z
ELLKULTUR
.....................................................................................................
42
2.9.1.
AUFTAUEN
UND
KRYOKONSERVIERUNG
DER
HEK293-ZELLEN................................
42
2.9.2.
PASSAGE
UND
TRANSFEKTION
DER
HEK293-ZELLEN
..........................................
42
2.10.
E
LEKTROPHYSIOLOGISCHE
C
HARAKTERISIERUNG
...............................................
43
2.10.1.
GRUNDLAGEN
DER
PATCH-CLAMP-TECHNIK
...................................................
43
2.10.2.
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
............................................................................
45
2.11.
S
TATISTIK
.........................................................................................................
48
3.
ERGEBNISSE
.......................................................................................................
49
3.1.
K
LONIERUNG
UND
M
UTAGENESE
HUMANER
P2X3-R
EZEPTORPLASMIDE
...............
49
3.2.
E
FFEKTE
DER
A
MINOSAEURESUBSTITUTION
IN
DEN
POSTULIERTEN
NBS
S
DES
HOMOTRIMEREN
P2X3-REZEPTORS
...................................................................................................
50
3.2.1.
KONZENTRATIONS-WIRKUNGS-BEZIEHUNGEN
.....................................................
50
3.2.2.
BESTIMMUNG
DER
ZEITKONSTANTEN
.................................................................
58
3.2.3.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
OBERFLAECHENEXPRESSION
.............................................
65
3.2.4.
DOPPELMUTATION
KONSERVIERTER
AMINOSAEUREN
IN
DEN
NBSS
..........................
66
3.3.
I
NTERAKTION
DER
R
EZEPTORUNTEREINHEITEN
IN
HOMO
-
UND
HETEROTRIMEREN
P2X-R
EZEPTOREN
.......................................................................................................
70
3.3.1.
KLONIERUNG
UND
MUTAGENESE
DER
HP2X2A
UND
HP2X6-PLASMIDE
...............
70
3.3.2.
KLONIERUNG
DES
KONKATEMERS
......................................................................
73
3.3.3.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE
CHARAKTERISIERUNG
HETEROTRIMERER
HP2X2/3-REZEPTOREN
.............................................................................................
76
3.3.4.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHER
FUNKTIONALITAETSTEST
DER
P2X6-UNTEREINHEIT
.............
80
3.3.5.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHER
FUNKTIONALITAETSTEST
DES
HOMOTRIMEREN
P2X3
KONKATEMERS
..........................................................................................................
81
4.
DISKUSSION.........................................................................................................
84
4.1.
D
IE
A
GONISTBINDUNG
AM
HOMOTRIMEREN
H
P2X3-R
EZEPTOR
............................
84
4.2.
I
NTERAKTION
DER
R
EZEPTORUNTEREINHEITEN
...................................................
91
4.2.1.
HETEROTRIMERE
P2X2/3-REZEPTOREN
.............................................................
91
4.2.2.
HETEROTRIMERE
P2X2/6-REZEPTOREN
.............................................................
92
4.2.3.
NUTZEN
UND
GRENZEN
DER
KONKATEMERE
......................................................
93
4.3.
M
OEGLICHKEITEN
UND
G
RENZEN
DER
A
LANIN
-M
UTAGENESESTUDIE
MITTELS
G
ANZZELLABLEITUNG
...................................................................................................
95
4.4.
A
USBLICK
.........................................................................................................
96
5.
ZUSAMMENFASSUNG.........................................................................................
99
6.
LITERATURVERZEICHNIS.................................................................................
104
7.
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
.............................................................................
111
8.
TABELLENVERZEICHNIS
..................................................................................
112
9.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
...........................................................................
113
10.
ANHANG
..........................................................................................................
115
10.1.
S
EQUENZIERPRIMER
........................................................................................
115
10.2.
B
ERECHNUNG
DER
KINETISCHEN
P
ARAMERTER
.................................................
116
10.2.1.
PARAMETER
ZUR
BERECHNUNG
DER
DESENSIBILISIERUNGSZEITEN
..................
116
10.2.2.
PARAMETER
ZUR
BERECHNUNG
DER
AUSWASCHZEITEN
.................................
117
10.3.
B
ESTIMMUNG
DER
O
BERFLAECHENEXPRESSION
.................................................
118
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