Replikation und Amplifizierung des Metall-Salen-Basenpaars:
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München
Verl. Dr. Hut
2011
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IMAGE 1
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG IV
SUMMARY IX
1. EINLEITUNG 1
1.1 NICHT-NATUERLICHE BASENPAARE IN DNA 1
1.1.1 ALTERNATIVE WASSERSTOFFBRUECKENBINDUNGEN 3
1.1.2 HYDROPHOBE WECHSELWIRKUNGEN ALS AUSREICHENDE VORAUSSETZUNG ZUR
BILDUNG SPEZIFISCHER BASENPAARE 7
1.2 METALL-BASENPAARE 12
1.2.1 STAPELN VON METALLIONEN IN DNA 18
1.2.2 STRUKTUREN METALL-VERMITTELTER BASENPAARE 21
1.2.3 VERWENDUNG VON METALLBASENPAAREN IN BIOCHEMISCHEN
UNTERSUCHUNGEN 22
2. AUFGABENSTELLUNG 25
3. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 27
3.1 SYNTHESE EINES SALICYLALDEHYDNUKLEOSIDTRIPHOSPHATS 27
3.1.1 VEREINFACHTE SYNTHESE DES TOLUOYL-GESCHUETZTEN 2'-DESOXYRIBOSYL-
CHLORIDS 28
3.1.2 TRIPHOSPHATSYNTHESE NACH LUDWIG UND RUTH 28
3.1.3 TRIPHOSPHATSYNTHESE NACH LUDWIG UND ECKSTEIN 32
3.2 ENZYMATISCHER EINBAU DES DSTP IN DNA 35
3.2.1 PRIMERVERLAENGERUNGSSTUDIEN 35
3.2.1.1 SYNTHESE EINES MODIFIZIERTEN TEMPLATSTRANGS 35
3.2.1.2 ERSTE PRIMERVERLAENGERUNGSREAKTIONEN MIT KLENOW(EXO
FRAGMENT 38
3.2.1.3 TEST VERSCHIEDENER POLYMERASEN ZUR PRIMERVERLAENGERUNG 41
3.2.1.4 PRIMERVERLAENGERUNGEN MIT BST POL I UNTER ZUGABE VERSCHIEDENER
ADDITIVE 43
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/101774680X
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
3.2.1.5 VERSUCHE ZUR FEHLPAARUNG DER DS-BASE MIT DEN NATUERLICHEN
DNA-BASEN 47
3.2.1.6 VOLLVERLAENGERUNG UNTER KOMPETITIVEN BEDINGUNGEN 52
3.2.2 POLYMERASEKETTENREAKTION 56
3.2.2.1 SYNTHESE DER TEMPLATSTRAENGE FUER DIE PCR 58
3.2.2.2 TEST VERSCHIEDENER POLYMERASEN UND ANNEA//NG-TEMPERATUREN.
61
3.2.2.3 EINFLUSS DER ADDITIVE ETHYLENDIAMIN UND CUSO 4 AUF DIE PCR
EINES MIT SALENBASENPAAREN MODIFIZIERTEN TEMPLATS 62
3.2.2.4 ENZYMATISCHER VERDAU DES PCR-PRODUKTS MIT
SALENBASENPAAREN 64
3.3 CO-KRISTALLSTRUKTUREN DER HIGH-FIDELITY POLYMERASE BST POL I MIT
SALICYLALDEHYD-MODIFIZIERTER DNA 69
3.3.1 SYNTHESE DER MODIFIZIERTEN DNA-STRAENGE 70
3.3.2 EXPRESSION UND AUFREINIGUNG VON BST POL I 71
3.3.3 KRISTALLISATION DER MODIFIZIERTEN DNA-STRAENGE IM KOMPLEX MIT
BST POLL 72
3.3.4 KRISTALLSTRUKTUREN 73
3.3.4.1 SALICYLALDEHYDBASE IN DER PRAE-INSERTIONSSTELLE DER POLYMERASE75
3.3.4.2 NICHTPAARENDE SALICYLALDEHYD-BASEN 75
3.3.4.3 STRUKTUR DES SALENBASENPAAR IN EINEM DNA-POLYMERASE- KOMPLEX 76
3.3.4.4 WEITERE KRISTALLISATIONSANSAETZE 78
3.4 AFM-EXPERIMENTE ZUR MECHANISCHEN STABILITAET VON DNA MIT METALL-
SALICYLALDEHYDBASENPAAR 79
3.4.1 THERMODYNAMISCHE STUDIEN 80
3.4.2 DURCHFUEHRUNG DER AFM-VERSUCHE 82
3.5 ENTWICKLUNG EINES SCHWEFELHALTIGEN METALL-BASENPAARS 86
3.5.1 SYNTHESE EINES GESCHUETZEN CARBAZYKLISCHEN AMIN-PHOSPHORAMIDITS
ZUM EINBAU IN DNA 88
3.5.1.1 EINBAU DES CARBAZYKLISCHEN AMIN-NUKLEOSIDS MIT TERT-
BUTOXYCARBONYL-SCHUTZGRUPPE 89
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.1.2 EINBAU DES CARBAZYKLISCHEN AMIN-NUKLEOSIDS MIT ACETYL-
SCHUTZGRUPPE 92
3.5.1.3 EINBAU DES CARBAZYKLISCHEN AMIN-NUKLEOSIDS MIT PHENYLACTEYL-
SCHUTZGRUPPE 95
3.5.1.4 EINBAU DES CARBAZYKLISCHEN AMIN-NUKLEOSIDS MIT ALLOC-
SCHUTZGRUPPE 98
3.5.2 UMSETZUNG DER MODIFIZIERTEN DNA-STRAENGE MIT CS 2 101
4. FAZIT UND AUSBLICK 104
5. EXPERIMENTELLER TEIL 107
5.1 CHEMISCHE SYNTHESE 107
5.1.1 MATERIAL UND METHODEN 107
5.1.2 DURCHFUEHRUNG DER SYNTHESE 109
5.1.2.1 SYNTHESE DES CHLORO-ZUCKERS 109
5.1.2.2 SYNTHESE DES SALICYLALDEHYDNUKLEOSIDTRIPHOSPHATS 111
5.1.2.3 SYNTHESE EINES GESCHUETZTEN CARBAZYKLISCHEN AMINNUKLEOSID-
PHOSPHORAMIDITS 122
5.1.3 OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE 138
5.1.3.1 SEQUENZEN DER DNA-STRAENGE: 141
5.1.3.2 BESTIMMUNG DER OLIGONUKLEOTID-KONZENTRATION 144
5.1.4 SCHMELZKURVEN VON OLIGONUKLEOTIDEN 144
5.2 BIOCHEMISCHE EXPERIMENTE 146
5.2.1 MATERIAL UND METHODEN 146
5.2.1.1 GERAETELISTE 146
5.2.1.2 PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN 148
5.2.1.3 ENZYME, PRIMERUND MARKER 150
5.2.2 PRIMER-VERLAENGERUNGSREAKTIONEN 151
5.2.3 POIYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 152
5.2.4 ENZYMATISCHER TOTALVERDAU 153
5.2.5 KRISTALLISATIONSEXPERIMENTE 155
5.2.5.1 TRANSFORMATION, EXPRESSION UND AUFREINIGUNG DER DNA
POLYMERASE BST POL I 155
5.2.5.2 KRISTALLISATIONSANSAETZE 156
IMAGE 4
5.2.5.3 KRISTALLSTRUKTURDATEN 157
6. ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 159
7. LITERATURVERZEICHNIS 163
LEBENSLAUF. 177 |
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