EInfluss intrazellulärer Nukleotid-Cofaktoren auf Redoxreaktionen in rekombinanten Ganzzellsystemen:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek
2011
|
| Series: | Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Gesundheit ; Bd. 42 |
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 STEREOSELEKTIVE SYNTHESEN 1
1.2 BIOKATALYTISCHE REAKTIONEN MIT ISOLIERTEN OXIDOREDUKTASEN 3 1.2.1
COFAKTORABHAENGIGKEIT VON OXIDOREDUKTASEN 7
1.2.2 METHODEN DER COFAKTORREGENERIERUNG 9
1.3 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN 13
1.4 BETRACHTUNG DER COFAKTOREN BEI BIOTRANSFORMATIONEN MIT RUHENDEN ZEL-
LEN 15
1.5 COFAKTORANALYTIK 17
2 ZIELSETZUNG 20
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 22
3.1 COFAKTORANALYTIK 22
3.1.1 QUANTIFIZIERUNG INTRAZELLULAERER COFAKTOREN 22
3.2 COFAKTORSTABILITAET WAEHREND DER PROBENAUFARBEITUNG UND DER MESSUNG 26
3.2.1 ZUSAMMENFASSUNG 28
3.3 INTRAZELLULAERE COFAKTORSTABILITAETEN IM ESCHERICHIA COZI-WIRTSSTAMM .
.. 29 3.3.1 ZUSAMMENFASSUNG 32
3.4 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN MIT SUBSTRAT-GEKOPPELTER COFAKTORREGE-
NERIERUNG 33
3.4.1 GANZZEILBIOTRANSFORMATION MIT DEM ADH/ADH-SYSTEM . . .. 33 3.4.2
KONTINUIERLICHE GANZZEILBIOTRANSFORMATION 33
3.4.3 COFAKTORSTABILITAET OHNE DEN EINFLUSS VON SUBSTRATEN UND PRO-
DUKTEN 38
3.4.4 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN IM SATZVERFAHREN 41 3.4.5
ZUSAMMENFASSUNG 47
3.5 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN MIT ENZYM-GEKOPPELTER COFAKTORREGENE-
RIERUNG 49
3.5.1 PRODUKTION UND AUFREINIGUNG DER ER 49
3.5.2 CHARAKTERISIERUNG DER ER 51
3.5.3 SYNTHESE VON (Z)-ETHYL-2-METHYL-3-NITROACRYLAT 52 3.5.4 REDUKTION
VON (Z)-ETHYL-2-METHYL-3-NITROACRYLAT MIT NATRIUM- BORHYDRID 54
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1017705984
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.5.5 ERMITTLUNG DER KINETISCHEN PARAMETER FUER (Z)-ETHYL-2-METHYL-3-
NITROACRYLAT 54
3.5.6 BIOKATALYTISCHE REDUKTION VON (Z)-ETHYL-2-METHYL- 3-NITROACRYLAT
MIT ISOLIERTER ER IM SATZREAKTOR 55
3.5.7 ZUSAMMENFASSUNG 58
3.6 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN MIT DEM ER/ADH-SYSTEM 59 3.6.1
KLONIERUNG UND TRANSFORMATION DES PCDF-DUET-IMDH- OYE- VEKTORS 59
3.6.2 EXPRESSIONSOPTIMIERUNG ER/ADH-SYSTEM 60
3.6.3 GANZZEILBIOTRANSFORMATION IM SATZVERFAHREN 63
3.6.4 KONTINUIERLICHE GANZZELLBIOTRANSFORMATION 66
3.6.5 ZUSAMMENFASSUNG 70
4 ZUSAMMENFASSUNG 72
5 AUSBLICK 75
6 MATERIALIEN UND METHODEN 77
6.1 CHEMIKALIEN 77
6.2 VERWENDETE GERAETE 77
6.3 VERWENDETE MATERIALIEN 80
6.4 BIOLOGISCHE MATERIALIEN 81
6.4.1 VERWENDETE PLASMIDE 81
6.4.2 VERWENDETE STAEMME 81
6.4.3 KLONIERUNG DES PCDF-DUET-OYE-LMDH-PLASMIDS 82 6.4.3.1 KLONIERUNG
DES IBADH-GENS UND DES OYE-GENS 82 6.4.3.2 PRAEPERATIVE AGAROSEGELE 88
6.5 EXPRESSIONSOPTIMIERUNG FUER DAS ER/ADH-SYSTEM 88
6.6 HERSTELLUNG DER GANZZEILBIOKATALYSATOREN 91
6.7 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN 93
6.7.1 ERMITTLUNG DER COFAKTORSTABILITAET OHNE DEN EINFLUSS VON SUB-
STRATEN 93
6.7.2 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN MIT DEM ADH/ADH-SYSTEM . . 94 6.7.2.1
KONTINUIERLICHE REAKTIONSFUEHRUNG 94
6.7.2.2 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN IM SATZVERFAHREN . . .. 95 6.7.3
GANZZELLBIOTRANSFORMATION MIT DEM ER/ADH-SYSTEM 95 6.7.3.1
KONTINUIERLICHE REAKTIONSFUEHRUNG 96
6.7.3.2 GANZZELLBIOTRANSFORMATIONEN IM SATZVERFAHREN . . .. 96 6.8
PRODUKTION UND AUFREINIGUNG DER ER 97
6.8.1 EXPRESSIONSOPTIMIERUNG DER ER 97
6.8.2 PRODUKTION DER ER IM 5 L MASSSTAB 98
6.8.3 ISOLIERUNG UND AUFREINIGUNG DER ER 98
6.8.4 CHARAKTERISIERUNG DER ER 99
II
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
6.8.5 BESTIMMUNG DER KINETISCHEN PARAMETER DER ER BEZUEGLICH (Z)-
ETHYL-2-METHYL-3-NITROACRYLAT 99
6.9 SYNTHESE VON (Z)-ETHYL-2-METHYL-3-NITROACRYLAT 100
6.10 REDUKTION VON (Z)-ETHYL-2-METHYL-3- NITROACRYLAT MIT
NATRIUMBORHYDRID 102 6.11 BIOKATALYSE MIT ISOLIERTER ER 103
6.12 ANALYTIK 103
6.12.1 BIOMASSESPEZIFISCHE ANALYTIK 103
6.12.1.1 BESTIMMUNG DER OPTISCHEN DICHTE 103
6.12.1.2 BESTIMMUNG DER BIOTROCKENMASSE 104
6.12.1.3 BESTIMMUNG DES ZELLVOLUMENS 104
6.12.1.4 VISUALISIERUNG DER ZELLINTEGRITAET 105
6.12.2 PROTEINANALYTIK 105
6.12.2.1 SDS-PAGE 105
6.12.2.2 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 106 6.12.2.3
AKTIVITAETSTEST FUER DIE ER 106
6.12.2.4 ERMITTLUNG DER COFAKTORABHAENGIGKEIT DER ER 107 6.12.2.5
AKTIVITAETSTEST FUER DEN GANZZELLBIOKATALYSATOR DES ADH/ADH-SYSTEM 107
6.12.2.6 AKTIVITAETSTEST FUER DEN GANZZELLBIOKATALYSATOR DES ER/ADH-SYSTEM
108
6.12.3 GASCHROMATOGRAPHIE 108
6.12.4 ENANTIOMERENANALYTIK 109
6.12.5 KERNRESONANZSPEKTROSKOPIE 111
6.12.6 COFAKTORANALYTIK 111
6.12.6.1 HERSTELLUNG DER 13 C-MARKIERTEN COFAKTORSTANDARDS . . 111
6.12.6.2 POBENAUFARBEITUNG 114
6.12.6.3 MESSUNG DER INTRAZELLULAEREN COFAKTORKONZENTRATIONEN 115
6.12.6.4 BESTIMMUNG DER STABILITAET DER COFAKTOREN WAEHREND DER
PROBENAUFARBEITUNG 118
LITERATURVERZEICHNIS 119
7 ANHANG 133
7.1 SEQUENZEN DER VERWENDETEN GENE 133
7.1.1 SEQUENZ DES ADH-GENS 133
7.1.2 SEQUENZ DES OYE-GENS 134
7.2 NMR-SPEKTREN DER NITRO-VERBINDUNGEN 135
7.3 CHROMATOGRAMME ENANTIOMERENANALYTIK 138
III
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