Systemische Analyse des Citratzyklus in Corynebacterium glutamicum:
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| Language: | German |
| Published: |
Jülich
Forschungszentrum Jülich, Zentralbibliothek
2011
|
| Series: | Schriften des Forschungszentrums Jülich
Reihe Gesundheit ; Bd. 41 |
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| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
TITEL SEITENZAHL
ZUSAMMENFASSUNG (ENGLISCH) 6
ZUSAMMENFASSUNG (DEUTSCH) 7
ABKUERZUNGEN 12
1. EINLEITUNG 14
1.1 CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM 14
1.2 BIOTECHNOLOGISCHE PRODUKTION VON LYSIN 15
1.3 CITRATSYNTHASE VON C. GLUTAMICUM 18
1.4 SYSTEMBIOLOGIE Z U M RATIONALEN STAMMDESIGN VON C. GLUTAMICUM 2 0
1.5 AUFGABENSTELLUNG 2 2
2. MATERIAL UND METHODEN 23
2.1 MATERIAL 2 3
2.1.1 STAEMME UND PLASMIDE 23
2.1.2 CHEMIKALIEN 27
2.2 METHODEN 2 8
2.2.1 KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN UND MEDIEN 28
2.2.1.1 MEDIEN 28
2.2.1.2 KULTIVIERUNG 29
2.2.1.2 KULTIVIERUNG IM BIOREAKTOR 29
2.2.1.2 STAMMHALTUNG 30
2.2.1.2 BESTIMMUNG DES BAKTERIENWACHSTUMS 30
2.2.2 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN 31
2.2.2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 31
2.2.2.2 BESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREKONZENTRATION 31
2.2.2.3 LIGATIONEN, MODIFIKATIONEN UND RESTRIKTIONSSPALTUNGEN VON DNA 31
2.2.2.4 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 32
2.2.2.5 TRANSFORMATION VON E. COLI UND C. GLUTAMICUM 32
2.2.2.6 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 33
2.2.2.7 DNA SEQUENZIERUNGEN 34
2.2.2.8 ISOLIERUNG VON RNA 34
2.2.2.9 SYNTHESE VON CDNA 35
2.2.2.10 RNA-IIGASE MEDIATED RAPID AMPLIFICATION OF CDNA ENDS (RLM-RACE)
35
9
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IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
2.2.2.11 NORTHERN BLOT 36
2.2.2.12 GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSEN (MICROARRAY) 36
2.2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE ARBEITEN 38
2.2.3.1 HERSTELLUNG ZELLFREIER EXTRAKTE 38
2.2.3.1 PROTEINBESTIMMUNG 38
2.2.3.2 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN 38
2.2.3.3 WESTERNBLOT 39
2.2.4 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON METABOLITEN 40
2.2.4.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON AMINOSAEUREN IM KULTURUEBERSTAND 40
2.2.4.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM KULTURUEBERSTAND 40
2.2.4.3 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON ORGANISCHEN SAEUREN IM
KULTURUEBERSTAND 41
2.2.4.4 QUANTITATIVE BESTIMMUNG INTRAZELLULAERER METABOLITE 41
2.2.4.5 QUANTITATIVE BESTIMMUNG EXTRAZELLULAERER RATEN DURCH EIN
PROZESSMODELL 41
3. ERGEBNIS 43
3.1 CHARAKTERISIERUNG D E R GLTA TRANSKRIPTE 4 3
3.1.1 UNTERSUCHUNG DER PROMOTORBEREICHE VON GLTA 43
3.1.2 ZWEI MONOCISTRONISCHE G/FA-TRANSKRIPTE 44
3.1.3 PROMOTOREN UND TERMINATOR VON GLTA 46
3.2 FKB (NCGL0796) EIN CHAPERON D E R CITRATSYNTHASE 4 7
3.3 REGULATION D E R GLTA TRANSKRIPTION IN C. GLUTAMICUM 4 8
3.3.1 G/FA-EXPRESSION BEI WACHSTUM AUF VERSCHIEDENEN KOHLENSTOFFQUELLEN
49
3.3.2 RAMA UND RAMB REGULIEREN DIE G/FA-EXPRESSION 51
3.4 AUSTAUSCH D E R GLTA-PROMOTOREN 5 4
3.4.1 AUSWAHL DER DAPA-PROMOTOREN 55
3.4.2 AUSWIRKUNGEN DER REDUZIERTEN DER CS-AKTIVITAET 56
3.4.3 BILDUNG DER CS-PROTEINE DURCH DIE DAPA-PROMOTOREN 57
3.4.4 VERRINGERTE CS WIRKT SICH AUF WACHSTUM UND LYSINAUSBEUTE AUS 58
3.5 GLOBALE AUSWIRKUNGEN D E R C S REDUKTION 6 2
3.5.1 VERGLEICHENDE GENOMWEITE EXPRESSIONSANALYSE 63
3.5.2 EINFLUSS VON ACEA, ACEB, PCK UND ODX AUF DIE LYSINAUSBEUTE 67
3.5.3 BESTIMMUNG INTERNER METABOLITKONZENTRATIONEN 68
3.6 KOHLENSTOFFBILANZEN UND RATENBESTIMMUNG 7 2
3.6.1 KULTIVIERUNG DER STAEMME UNTER BATCH-BEDINGUNGEN IM BIOREAKTOR 72
3.7 SUPPLEMENTATION D E R DM1800-CS-DAPA-PROMOTORMUTANTEN 7 5
3.7.1 SUPPLEMENTATION MIT GLUTAMAT, ARGININ, PROLIN UND CITRAT 76
3.7.2 CHARAKTERISIERUNG DER PROLIN-SUPPLEMENTATION VON DM1800 C7 77
10
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
3.7.3 VERGLEICH VON PROLIN- UND BETAINZUGABE BEI REDUZIERTER
CS-AKTIVITAET 79
3.7.4 KOHLENSTOFFBILANZ UND EXTRAZELLULAERE RATEN BEI
PROLINSUPPLEMENTATION 81
3.8 BEARBEITUNG WEITERER ZIELGENE ZUR VERBESSERTEN LYSINPRODUKTION 8 3
3.8.1 PYRUVATDEHYDROGENASE 83
3.8.2 GLUCOSE-6-PHOSPHATDEHYDROGENASE 84
4. DISKUSSION 87
4.1 CHARAKTERISIERUNG D E R GLTA (CITRATSYNTHASE) TRANSKRIPTION 8 7
4.2 PROMOTORAUSTAUSCH D E R CITRATSYNTHASE 8 9
4.3 GLOBALE AUSWIRKUNGEN D E R CITRATSYNTHASEREDUKTION 9 0
4.4 EXTRAZELLULAERE FLUESSE UND KOHLENSTOFFBILANZEN 9 4
4.5 SUPPLEMENTATION D E R CS-MUTANTEN 9 5
4.6 EXPRESSION D E R GLUCOSE-6-PHOSPHATDEHYDROGENASE 9 6
5. LITERATURVERZEICHNIS 98
ANHANG 110
DANKSAGUNG 116
11
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