Die funktionelle Relevanz des Chemokin-ähnlichen Rezeptors GPR33:
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DIE FUNKTIONELLE RELEVANZ DES
CHEMOKIN-AEHNLICHEN REZEPTORS GPR33
VON DER FAKULTAET FUER BIOWISSENSCHAFTEN, PHARMAZIE UND PSYCHOLOGIE DER
UNIVERSITAET LEIPZIG
GENEHMIGTE
D I S S E R T A T I ON
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
DOCTOR RERUM NATURALIUM
DR. RER. NAT.
VORGELEGT
VON DIPLOM-BIOCHEMIKER JENS BOHNEKAMP
GEBOREN AM 29.05.1981 IN OSCHATZ
DEKAN: PROF. DR. MATTHIAS MUELLER
GUTACHTER: PROF. DR. MARIO MOERL
PROF. DR. TORSTEN SCHOENEBERG
TAG DER VERTEIDIGUNG: 04.02.2011
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010510797
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
A INHALTSVERZEICHNIS
A INHALTSVERZEICHNIS IL
B ABKUERZUNGSVERZEICHNIS V
C ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII
D TABELLENVERZEICHNIS IX
1 EINLEITUNG 1
1.1 ALLGEMEINER AUFBAU, EINTEILUNG UND SIGNALTRANSDUKTION VON G-PROTEIN-
GEKOPPELTEN REZEPTOREN 1
1.2 FUNKTIONEN VON G-PROTEIN-GEKOPPELTEN REZEPTOREN IM IMMUNSYSTEM 4
1.3 ORPHAN G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOREN 5
1.4 DER ORPHAN G-PROTEIN-GEKOPPELTE REZEPTOR 33 7
2 ZIELSTELLUNG 11
3 MATERIAL UND METHODEN 13
3.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 13
3.2 VERWENDETE SYSTEME 13
3.3 ZELLSYSTEME UND VEKTOREN 14
3.4 MEDIEN, PUFFER, LOESUNGEN 15
3.4.1 BAKTERIENKULTUR 15
3.4.2 DNA-PRAEPARATION 15
3.4.3 ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) 15
3.4.4 GELELEKTROPHORESE 16
3.4.5 LUCIFERASE ASSAY 16
3.4.6 INOSITOLPHOSPHAT (IPI)-AKKUMULATIONS-ASSAY 17
3.4.7 SPLENOZYTEN-KULTUR 17
3.4.8 TRANSFEKTION 17
3.4.9 ZELLKULTUR 17
3.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 19
3.5.1 ELISA 19
3.5.2 KLONIERUNG VON ZUM GPR33-Y225N HOMOLOGEN REZEPTORMUTANTEN 21
3.5.3 INOSITOLPHOSPHAT (IPI)-AKKUMULATIONS-ASSAY 21
3.5.4 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION) 22
3.5.5 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA 23
II
IMAGE 3
3.5.6 SEQUENZIERUNG 24
3.6 EXPRESSIONSANALYSEN 24
3.6.1 5 -RACE (RAPIDAMPLIFICATION OFCDNA ENDS) 24
3.6.2 DC-STIMULATIONS- UND INHIBITIONSVERSUCHE 25
3.6.3 DURCHFLUSSZYTOMETRIE (F ACS: FLUORESCENCE ACTIVATED CELL SORTING)
25
3.6.4 LUCIFERASE-REPORTERGEN-ASSAY 26
3.6.5 QUANTITATIVE REAL-TIME PCR (QPCR) 26
3.6.6 RNA-ISOLATION 27
3.6.7 STIMULATION VON MAEUSEN MIT AGONISTEN DER TOLL-//E-REZEPTOREN
(TLR) 28
3.6.8 UNTERSUCHUNG DER HUMANEN GPR33-ALLELVERTEILUNG BEI EINEM
HETEROZYGOTEN PROBANDEN 28
3.6.9 VITALITAETSTESTS 28
3.7 TIERHALTUNG 29
3.7.1 GENOTYPISIERUNG 29
3.8 KULTUR VON ZELLLINIEN 30
3.8.1 PRODUKTION VON MURINEN GM-CSF 30
3.9 PRIMAERZELLKULTUR UND-ISOLATION 31
3.9.1 GEWINNUNG VON LUNGENLAVAGE-ZELLEN BEIM SCHWEIN 31
3.9.2 SPLENOZYTEN-SEPARATION 31
3.9.3 SPLENOZYTEN-KULTUR 31
3.9.4 PRAEPARATION MURINER DENDRITISCHER VORLAEUFERZELLEN AUS KNOCHENMARK
32
3.9.5 PRAEPARATION HUMANER DC AUS CD14-POSITIVEN BLUTMONOZYTEN 33
ERGEBNISSE 34
4.1 MURINE GPR33-MRNA-EXPRESSIONSANALYSEN 34
4.1.1 QUANTIFIZIERUNG DER GPR33-MRNA-EXPRESSION IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN
35 4.1.2 ZELLSPEZIFISCHE GPR33-MRNA-EXPRESSION 36
4.1.3 VERGLEICH DER GEWEBE- UND ZELLSPEZIFISCHEN EXPRESSIONSDATEN MIT
MICROARRAY- DATEN 37
4.1.4 UNTERSUCHUNGEN ZUR REGULATION DER GPR33-MRNA-EXPRESSION IN MURINEN
DC 39
4.1.5 EX VIVO-STIMULATION DER GPR33-MRNA-EXPRESSIONSERHOEHUNG 41
4.1.6 IN VIVO-STIMULATION DER GPR33-MRNA-EXPRESSIONSERHOEHUNG 43
4.2 UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON AP-1 UND N F - KB AUF DIE MURINE
GPR33- MRNA-EXPRESSION 44
4.2.1 IDENTIFIZIERUNG DES MURINEN GPR33-TRANSKRIPTIONSSTARTBEREICHES 44
4.2.2 BIOINFORMATISCHE ANALYSE DES POTENTIELLEN GPR33-PROMOTORBEREICHES
45
4.2.3 LUCIFERASE-REPORTERGEN-ASSAY ZUR UEBERPRUEFUNG DER PROMOTORAKTIVITAET
47
4.2.4 INHIBITIONSVERSUCHE ZUM BEWEIS DER AP-1- UND NF-KB-ABHAENGIGKEIT
DER MURINEN GPR33-EXPRESSION 48
III
IMAGE 4
4.3 UNTERSUCHUNG DES HUMANEN GPR33 51
4.3.1 DESIGN HUMANSPEZIFISCHER GPR33-QPCR-PRIMER 51
4.3.2 EXPRESSION DER HUMANEN GPR33-MRNA IN DC 54
4.3.3 EXPRESSIONSUNTERSCHIEDE ZWISCHEN DEM INTAKTEN UND DEM
PSEUDOGENISIERTEN HUMANEN GPR33 55
4.3.4 EINFLUSS VON TLR-AGONISTEN BZW. AP-1- UND NF-KB-STIMULATOREN AUF
DIE EXPRESSION DER HUMANEN GPR33-MRNA IN DC 55
4.4 EXPRESSIONSANALYSEN DES RATTEN-GPR33-PSEUDOGENS 57
4.4.1 ORGANSPEZIFISCHE GPR33-MRNA-EXPRESSION 57
4.4.2 EINFLUSS VON TLR-AGONISTEN BZW. AP-1- UND NF-KB-STIMULATOREN AUF
DIE RATTEN- GPR33-MRNA-EXPRESSION IN DC 58
4.4.3 EX VIVO-STIMULATION DER GPR33-MRNA-EXPRESSIONSERHOEHUNG 59
4.4.4 VERGLEICH DES POTENTIELLEN GPR33-PROMOTORBEREICHES BEI RATTE UND
MAUS 60
4.5 GPR33-Y225N-MAUSMODELL 61
4.5.1 VALIDIERUNG DER GPR33-Y225N-MUTANTE 61
4.5.2 UNTERSUCHUNG DER Y225N-MUTATION BZW. HOMOLOGER MUTATIONEN BEI NAH
VERWANDTEN REZEPTOREN 64
4.5.3 CHARAKTERISIERUNG DES GPR33-Y225N-MAUSMODELLS 66
5 DISKUSSION 67
5.1 DIE GPR33-Y225N-MUTATION ERFUELLT NICHT DIE KRITERIEN EINES
FUNKTIONEILEN REZEPTOR-KNOCKOUTS 68
5.2 DIE MURINE GPR33-MRNA IST AM HOECHSTEN IN IMMUNOLOGISCH RELEVANTEN
GEWEBEN UND DC EXPRIMIERT 69
5.3 DIE MURINE GPR33-MRNA-EXPRESSION IST VON DEN TRANSKRIPTIONSFAKTOREN
AP-1 UND NF-KB ABHAENGIG 72
5.4 CHARAKTERISIERUNG DER MURINEN GPR33-GENSTRUKTUR 77
5.5 EXPRESSION UND EXPRESSIONSREGULATION VON GPR33-PSEUDOGENEN IN MENSCH
UND RATTE 79
6 AUSBLICK 82
7 ZUSAMMENFASSUNG 84
8 SUMMARY 87
9 LITERATURVERZEICHNIS 90
10 ANHANG 96
10.1 GETESTETE SUBSTANZEN FUER STIMULATIONSVERSUCHE 96
10.2 VERWENDETE PRIMER 100
DANKSAGUNG 103
SELBSTSTAENDIGKEITSERKLAERUNG 104
IV
IMAGE 5
CURRICULUM VITAE 105
WISSENSCHAFTLICHE VEROEFFENTLICHUNGEN 106
|
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