Gentechnische Herstellung und Charakterisierung der Exotoxine Beta und Beta2 von Chlostridium perfringens:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
Gießen
DVG-Service
2010
|
| Edition: | 1. Aufl. |
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INHALTSVERZEICHNIS
.................................................................................................................
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
...................................................................................................
IV
1
EINLEITUNG...............................................................................................................
1
2
SCHRIFTTUM
.............................................................................................................
3
2.1
C.
PERFRINGENS
TOXINE
BETA
UND
BETA2
....................................................................................
3
2.1.1
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DES
BETA-TOXINS
.........................................................................................
3
2.1.2
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
DES
BETA2-TOXINS
.......................................................................................4
2.1.3
DIE
GEWINNUNG
DER
TOXINE
...........................................................................................................
6
2.2
EXPRESSIONSWIRTE
E.
COLI
UND
B.
SUBTILIS
...............................................................................
10
2.3
PROTEINE
......................................................................................................................................
12
2.3.1
STRUKTUR
........................................................................................................................................
12
2.3.2
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
UND
NATIVE
KONFORMATION
.........................................................................
12
2.3.3
INAKTIVIERUNG
UND
DENATURIERUNG
...............................................................................................
13
2.4
MOEGLICHE
EINFLUESSE
AUF
DIE
BIOLOGISCHE
AKTIVITAET
VON
REKOMBINANTEN
PROTEINEN
........
14
2.4.1
EXPRESSIONSWIRT
..........................................................................................................................
14
2.4.2
SEQUENZMODIFIKATIONEN
UND
AFFINITAETSANHAENGSEL
.....................................................................
18
2.4.3
EINSCHLUSSKOERPERCHEN
..................................................................................................................20
2.4.4
TEMPERATUR
.................................................................................................................................
21
2.4.5
EINFRIER
UND
AUFTAUPROZESSE
.....................................................................................................
21
2.4.6
MECHANISCHE
UND
PHYSIKALISCHE
EINFLUESSE
...............................................................................
22
2.4.7
CHEMISCHE
INTERAKTIONEN
UND
EINFLUESSE
DES
LOESUNGSMITTELS
..................................................24
2.4.8
SAUERSTOFF
...................................................................................................................................25
2.4.9
PH-WERT
.......................................................................................................................................
26
3
MATERIAL
UND
METHODEN
.................................................................................
28
3.1
MATERIALIEN
UND
VERSUCHSTIERE
...............................................................................................28
3.1.1
VERBRAUCHSMATERIALIEN
UND
PUFFER
.............................................................................................28
3.1.2
GERAETE
........................................................................................................................................
28
3.1.3
BAKTERIENSTAEMME
UND
GVO
......................................................................................................
28
3.1.4
ZELLLINIEN
.....................................................................................................................................28
3.1.5
VERSUCHSTIERE
.............................................................................................................................
28
3.1.6
PRIMER
..........................................................................................................................................
31
3.2
BAKTERIOLOGISCHE
METHODEN
....................................................................................................32
3.2.1
ANZUCHT
VON
BAKTERIENSTAEMMEN
...............................................................................................
32
3.2.2
EXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
TOXINE
IN
E.
COLI
......................................................................
33
3.2.3
EXPRESSION
DES
REKOMBINANTEN
BETA2-TOXINS
IN
B.
SUBTILIS
....................................................
33
3.2.4
HERSTELLUNG
CHEMOKOMPETENTER
E.
COLI
MIT
DER
CACI
2
-METHODE
..............................................
33
3.2.5
LAGERUNG
VON
BAKTERIEN
.............................................................................................................
33
3.3
TECHNIKEN
FUER
DIE
IN-VITRO-REKOMBINATION
...........................................................................34
3.3.1
FREISETZUNG
UND
AUFREINIGUNG
VON
DNA
....................................................................................
34
3.3.2
BESTIMMUNG
VON
REINHEIT
UND
KONZENTRATION
DER
DNA
...........................................................
35
3.3.3
POLYMERASE-KETTENRAKTION
(PCR)
.......................................................................................................
35
3.3.4
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
........................................................................................................
36
3.3.5
RESTRIKTIONSVERSUCHE
..................................................................................................................
36
3.3.6
LIGATIONSVERSUCHE
......................................................................................................................
36
3.3.7
TRANSFORMATIONSVERSUCHE
..........................................................................................................
38
3.3.8
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSFORMANTEN
MITTELS
PCR
UND
SEQUENZIERUNG
.....................................
39
3.4
KLONIERUNGSSTRATEGIEN
.................................
41
3.5
PROTEINPRAEPARATIVE
UND
-ANALYTISCHE
METHODEN
..................................................................
43
3.5.1
GEWINNUNG
UND
AUFREINIGUNG
DER
REKOMBINANTEN
TOXINE
AUS
E.
COLI
....................................
43
3.5.2
TEILAUFREINIGUNG
DES
RBETA2-TOXINS
AUS
WB800N-(PHIT-VLC-51)-KULTURUEBERSTAENDEN
.........
44
3.5.3
BESTIMMUNG
DER
PROTEINKONZENTRATION
.....................................................................................
44
3.5.4
SDS-PAGE
..................................................................................................................................
44
3.5.5
STREP-TAG
LL-WESTERN
BLOT
.......................................................................................................
45
3.5.6
IMMUNBLOT
....................................................................................................................................
45
3.5.7
BIO-X
ENTEROTOXAEMIE
ELISA
KIT
.................................................................................................
46
3.5.8
BETA2-TOXIN-FANGANTIKOERPER-ELISA
..........................................................................................
46
3.5.9
RENATURIERUNGSVERSUCHE
MIT
REKOMBINANTEM
BETA2-TOXIN
.....................................................
46
3.6
ZELLKULTURMETHODEN
..................................................................................................................
48
3.6.1
KULTIVIERUNG
DER
ZELLLINIEN
..........................................................................................................
48
3.6.2
UEBERPRUEFUNG
DER
TOXISCHEN
WIRKUNG
DER
RBETA2-TOXINE
AUF
CACO-2-ZELLEN
...........................
48
3.6.3
UEBERPRUEFUNG
DER
TOXISCHEN
WIRKUNG
DER
RBETA2-TOXINE
AUF
IPEC-J2-ZELLEN
.........................
49
3.7
TIERVERSUCHE
.............................................................................................................................
49
3.7.1
TIERHALTUNG
.................................................................................................................................
49
3.7.2
INJEKTIONTECHNIKEN
.......................................................................................................................
49
3.7.3
NARKOSE
.......................................................................................................................................
49
3.7.4
BELASTUNGSVERSUCHE
...................................................................................................................
50
4
ERGEBNISSE
...........................................................................................................
51
4.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
BETA-TOXIN
..........................................................................................
51
4.1.1
ERZEUGUNG
DES
GVO
TOP10F -(PHIT-VLC-42)
.........................................................................
51
4.1.2
NACHWEIS
DES
REKOMBINANTEN
BETA-TOXINS
..............................................................................54
4.1.3
BESTIMMUNG
DER
AUSBEUTE
UND
DER
KONZENTRATION
VON
RBETA-PRAEPARATIONEN
........................55
4.1.4
NACHWEIS
DER
BIOLOGISCHEN
AKTIVITAET
DES
REKOMBINANTEN
BETA-TOXINS
IM
MAUSMODELL
........
56
4.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
BETA2-TOXIN
.................................................................................
57
4.2.1
HERSTELLUNG
VON
GVO
ZUR
REKOMBINANTEN
EXPRESSION
DES
BETA2-TOXINS
..............................
57
4.2.2
NACHWEIS
VON
REKOMBINANTEM
BETA2-TOXIN
IN
EXPRESSIONSPRODUKTEN
DER
GVO
..................
64
4.2.3
NACHWEIS
DER
BIOLOGISCHEN
WIRKUNG
DER
RBETA2-TOXINE
.........................................................
71
5
DISKUSSION
............................................................................................................
77
6
ZUSAMMENFASSUNG
...........................................................................................
89
7
SUMMARY
................................................................................................................
91
8
ANHANG
..................................................................................................................
92
9
LITERATURVERZEICHNIS
.....................................................................................
98
10
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
...............................................................................
112
10.1
ABBILDUNGEN
...........................................................................................................................
112
10.2
TABELLEN
...................................................................................................................................
115
|
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