Hypoxia-inducible [Factor-1-alpha-targeted] small interfering RNA inhibiert die hypoxische Akkumulation von [HIF-1-alpha] und erhöht die Strahlensensitivität von HT-1080-Fibrosarkomzellen in vitro:
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2010
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I
NHALTSVERZEICHNIS
.....................................................................................
1
1
E
INLEITUNG
...............................................................................................
1
1.1
DAS
TUMORMIKROMILIEU
...............................................................................
2
1.2
DURCHBLUTUNG
UND
OXYGENIERUNG
MENSCHLICHER
TUMORE
..........................
3
1.3
DER
SAUERSTOFFEFFEKT
...................................................................................
5
1.4
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
HIF
......................................................................
6
1.4.1
STRUKTUR
VON
HIF
.....................................................................................
7
1.4.2
REGULATION
DER
HIF-AKTIVITAET
..................................................................
7
1.4.3
HIF-1
REGULIERTE
GENE
UND
DEREN
PRODUKTE
........................................
10
1.5
BEDEUTUNG
VON
HIF
BEI
DER
ANTWORT
DES
ORGANISMUS
AUF
HYPOXIE
.....
11
1.6
HIF-SUPPRESSION
DURCH
RNA-INTERFERENZ
.................................................
12
1.7
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
............................................................................
13
2
M
ATERIAL
UND
M
ETHODEN
..................................................................
14
2.1
GERAETE
.........................................................................................................
14
2.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
...............................................................................
16
2.2.1
LABORMATERIALIEN
..................................................................................
16
2.2.2
KITS
........................................................................................................
17
2.2.3
REAGENZIEN
..........................................................................................
17
2.2.4
LOESUNGEN
UND
BUFFER
............................................................................
19
2.2.4.1
LB1-BUFFER
......................................................................................
19
2.2.4.2
LB2-BUFFER
......................................................................................
20
2.2.4.3
RIPA-BUFFER
....................................................................................
20
2.2.4.4
STRIPPING
BUFFER
..............................................................................
21
2.2.4.5
PBS
TWEEN
..................................................................................
21
2.2.4.6
ELEKTROPHORESEBUFFER
.....................................................................
21
2.2.4.7
TRANSFER
BUFFER
................................................................................
22
2.2.4.8
MILCH
................................................................................................
22
2.2.4.9
FIXIERLOESUNG
....................................................................................
22
2.2.5
MEDIEN
..................................................................................................
22
2.2.5.1
MEMALPHA-MEDIUM
.........................................................................
22
2.2.5.2
ELEKTROPORATIONSMEDIUM
................................................................
23
2.2.6
PRIMER
....................................................................................................
23
2.2.7
SONDEN
..................................................................................................
23
2.2.8
SIRNAS
..................................................................................................
24
2.2.9
ANTIKOERPER
.............................................................................................
24
2.3
ARBEITEN
MIT
HUMANEN
FIBROSARKOMZELLEN
............................................
...25
2.3.1
ZELLLINIE
..................................................................................................
25
2.3.2
STERILES
ARBEITEN
...................................................................................
25
2.3.3
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
...................................................................
25
2.3.4
MONOLAYERKULTUREN
................................................................................
26
2.3.5
ANLEGEN
UND
AUFTAUEN
VON
TUMORZELLLINIEN
........................................
27
2.3.6
VERSUCHSVORBEREITUNGEN
.....................................................................
27
2.3.7
ELEKTROPORATION
................................................
28
2.4
ARBEITEN
AM
DURCHFLUSSZYTOMETER
.............................................................
29
2.5
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
...............................................................................
31
2.5.1
KERNEXTRAKTE
.........................................................................................
32
2.5.2
PHOTOMETRIE
..........................................................................................
33
2.5.3
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
................................................
36
2.5.4
WESTERN
BLOT
.........................................................................................
37
2.5.5
DENSITOMETRIE
.......................................................................................40
2.6
ARBEITEN
MIT
RNA
.......................................................................................
41
2.6.1
ISOLIERUNG
VON
TOTAL-RNA
AUS
TUMORZELLEN
........................................
41
2.6.2
BESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEURE-KONZENTRATIONEN
...............................
41
2.6.3
UMSCHREIBEN
VON
RNA
IN
CDNA
..........................................................42
2.6.4
QUANTITATIVE
REALTIME
PCR
(QRT-PCR)
..............................................
43
2.6.5
NORMALISIERUNG
GEGEN
DAS
SS2M
HOUSEKEEPING-GEN
...........................
44
2.6.6
SCHMELZKURVENANALYSE
.......................................................................
46
2.7
KOLONIEBILDUNGSTEST
....................................................................................
46
2.7.1
MATHEMATISCHE
BESCHREIBUNG
.............................................................
47
2.7.2
UEBERLEBENSKURVEN
................................................................................
48
2.7.3
OER
UND
OER
.....................................................................................
48
2.7.4
VERSUCHSDURCHFUEHRUNG
........................................................................
49
2.7.5
FIXIERUNG
DES
KOLONIEBILDUNGSTESTS
.....................................................
51
2.8
STATISTIK
.......................................................................................................
52
3
E
RGEBNISSE
...........................................................................................
53
3.1
VERSUCHSBEDINGUNGEN
...............................................................................
53
3.1.1
ERMITTLUNG
DER
OPTIMALEN
ELEKTROPORATIONSSPANNUNG
............................
53
3.1.2
ERMITTLUNG
DES
OPTIMALEN
ZEITFENSTERS
...................................................
55
3.2
VALIDIERUNG
DER
SIRNA
...............................................................................
57
3.3
EINFLUSS
DER
SIRNA
AUF
DIE
HIF-1A
TRANSKRIPTION
.....................................
58
3.4
EINFLUSS
DER
SIRNA
AUF
HIF-1A
ABHAENGIGE
EGFP-EXPRESSION
................
59
3.5
EINFLUSS
DER
SIRNA
AUF
DIE
HIF-1A
TRANSLATION
........................................
63
3.6
AUSWERTUNG
DES
KOLONIEBILDUNGSTESTS
.....................................................
65
3.6.1
SURVIVAL
FRACTION
....................................................................................
65
3.6.2
KOLONIALES
UEBERLEBEN
..........................................................................
67
4
D
ISKUSSION
............................................................................................
70
4.1
KLINISCHE
BEDEUTUNG
DER
TUMORHYPOXIE
..................................................
70
4.2
THERAPIEOPTIONEN
BEI
TUMORHYPOXIE
.......................................................
72
4.2.1
VERBESSERUNG
DER
OXIGENIERUNG
........................................................
72
4.2.1.1
ANAEMIEKORREKTUR
............................................................................
72
4.2.1.2
MODULIERUNG
DER
OXYGENIERUNG
......................................................
73
4.2.2
BIOREDUKTIVE
SUBSTANZEN
.....................................................................
74
4.2.3
REKOMBINANTE
ANAEROBIER
...................................................................
74
4.3
AKKUMULATION
VON
HIF-1A
..........................................................................
75
4.4
MOEGLICHKEITEN
DER
HIF-1A-SUPPRESSION
....................................................
76
4.4.1
CHETOMIN
...............................................................................................
76
4.4.2
HIF-A-TARGETING
SIRNA
..........................................................................
77
4.2.2
CHETOMIN
UND
HIF-1A-TARGETED
SIRNA
IM
VERGLEICH
..........................
78
4.3
HIF-1
ALS
POTENTIELLES
TARGET
IN
DER
TUMORTHERAPIE
...............................
78
5
ZUSAMMENFASSUNG
.............................................................................
81
6
L
ITERATURVERZEICHNIS
.........................................................................
82
7
A
BBILDUNGSVERZEICHNIS
.....................................................................
92
8
TABELLENVERZEICHNIS
.........................................................................
95
9
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
...................................................................
96
C
URRICULUM
V
ITAE
.....................................................................................
99
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