Herstellung und Analyse einer B-Zell-spezifischen Grb2-defizienten Mauslinie:
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HERSTELLUNG UND ANALYSE EINER
B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-DEFIZIENTEN
MAUSLINIE
DER NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET DER FRIEDRICH-ALEXANDER-UNIVERSITAET
ERLANGEN-NUERNBERG ZUR ERLANGUNG
DES DOKTORGRADES DR. RER. NAT.
VORGELEGT VON
JOCHEN ACKERMANN
AUS NUERNBERG
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010461710
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1.1 ENTWICKLUNG B-LYMPHOIDER ZELLEN 1
1.2 PLASMAZELLDIFFERENZIERUNG, KEIMZENTREN, GEDAECHTNIS-B-ZELLEN 5
1.3SIGNALTRANSDUKTION IN B-ZELLEN 6
1.4 DAS ADAPTORPROTEIN GRB2 10
2 ZIELSETZUNG 13
3 MATERIAL 14
3.1 ANTIKOERPER 14
3.1.1 ANTIKOERPER UND STREPTAVIDIN-KONJUGATE FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE
14
3.1.2 ANTIKOERPER FUER DIE KOMPLEMENTVERMITTELTE B- UND T-ZELL-LYSE 15
3.1.3 ANTIKOERPER UND KONJUGATE FUER HISTOLOGIE 15
3.1.4 ANTIKOERPER FUER ELISA 15
3.1.5 ANTIKOERPER FUER WESTERN BLOT 16
3.1.6 ANTIKOERPER ZUR STIMULATION 16
3.2 ANTIBIOTIKA UND INHIBITOREN 16
3.3 CHEMIKALIEN 17
3.4 ENZYME 18
3.5 PUFFER, LOESUNGEN UND MEDIEN 19
3.6 OLIGONUKLEOTIDE 24
3.7 VERWENDETE MAUSSTAEMME UND ES-ZELL-LINIEN 25
3.8 KITS 25
3.9 GERAETE 26
IMAGE 3
3.10 SOFTWARE 26
4 METHODEN 27
4.1 HERSTELLUNG B-ZELL-SPEZIFISCHER GRB2-DEFIZIENTER MAEUSE 27
4.1.1 KULTIVIERUNG VON EMFIS 27
4.1.2 AUFTAUEN VON ES-ZELLEN 27
4.1.3 KULTIVIEREN UND PASSAGIEREN VON ES-ZELLEN 27
4.1.4 EINFRIEREN VON ES-ZELLEN 28
4.1.5 VORBEREITEN VON ES-ZELLEN FUER DIE BLASTOZYSTENINJEKTION 28
4.2 ZELLPRAEPARATION UND DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSE 29
4.2.1 PRAEPARATION VON ZELLEN AUS MAUSGEWEBEN 29
4.2.2 ZELLZAHL-BESTIMMUNG 29
4.2.3 EXTRAZELLULAERES FAERBEN VON OBERFLACHENMARKERN FUER
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN 30
4.2.4 FIXIEREN VON FLUORESZENZ-MARKIERTEN ZELLEN FUER
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE ANALYSEN 30
4.2.5 INTRAZELLULAERE FACS-ANFAERBUNGEN FUER PHOSPHOPROTEINE 30
4.2.6 ZELLZYKLUSANLYSE DURCH DAPI-ANFAERBUNGEN VON ZELLEN 31
4.2.7 ZELLSORTIERUNG MARKIERTER ZELLEN AM MOFLO ZELLSORTER
(FAC/7/FYAMNIKOLAUS-FIEBIGER-ZENTRUM) 31
4.3 ADOPTIVER KNOCHENMARKSTRANSFER 32
4.3.1 KOMPLEMENT-VERMITTELTE T- UND B-ZELL-LYSE 32
4.3.2 ZELLTRANSFER 32
4.4 BRDU-GABE UND MESSUNG 33
4.5 MESSUNG DES BZR-INDUZIERTEN CALCIUMSIGNALS IN PRIMAERZELLEN 33
IMAGE 4
4.6 PROLIFERATIONSMESSUNGEN MIT THYMIDINEINBAU 34
4.7 ANALYSE DER ANTIKOERPERTITER 34
4.7.1 IMMUNISIERUNGEN 34
4.7.2 PRAEPARATION VON SERUM 35
4.7.3 ELISA 35
4.8 ANFERTIGEN VON MILZ-GEFRIERSCHNITTEN 36
4.9 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 37
4.9.1 LYSIEREN VON ZELLEN FUER WESTERN BLOT-ANALYSEN 37
4.9.2 AUFTRENNUNG VON PROTEINEN DURCH GELELEKTROPHORESE 37
4.9.3 WESTERN BLOT UND PROTEINDETEKTION 37
4.10 NUKLEINSAEURE-SPEZIFISCHE METHODEN 38
4.10.1 ISOLATION FUER SCHWANZ-DNA FUER PCR ANALYSEN 38
4.10.2 TYPISIERUNGEN MITTELS PCR 38
4.10.3 ISOLATION VON ES-ZELL-DNA 40
4.10.4 VERDAU GENOMISCHER DNA FUER DEN SOUTHERN BLOT 41
4.10.5 AUFTRENNUNG DER VERDAUTEN, GENOMISCHEN DNA IM SOUTHERN-GEL 41
4.10.6 SOUTHERN BLOT 41
4.10.7 HYBRIDISIERUNG 42
4.11 STATISTISCHE ANALYSEN 42
5 ERGEBNISSE 43
5.1 HERSTELLUNG DER B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2- IEFIZIENTEN MAEUSE 43
5.2 BESTAETIGUNG DER B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-DEFIZIENZ 45
5.3 REDUZIERTE ZAHL REIFER, REZIRKULIERENDER B-ZELLEN IM KNOCHENMARK VON
B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN 46
IMAGE 5
5.4 REDUZIERTE ZELLZAHLEN REIFER UND TRANSITIONALER B-ZELLEN IN DER MILZ
VON
B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN 48
5.5 REDUZIERTE B-ZELLZAHLEN IM BLUT VON B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/-
MAEUSEN 53
5.6 LYMPHOZYTEN-POPULATIONEN IN DEN LYMPHKNOTEN VON B-ZELL-SPEZIFISCHEN
GRB2-/- MAEUSEN 54
5.7 LYMPHOZYTEN-POPULATIONEN IN DER BAUCHHOEHLE B-ZELL-SPEZIFISCHER
GRB2-/- MAEUSE 54
5.8 GRB2-DEFIZIENTE PRO- UND PRAE-B-ZELLEN SIND WILDTYPZELLEN IN DIREKTER
KONKURRENZ
UNTERLEGEN 55
5.9 LYMPHOZYTEN-POPULATIONEN IN DER MILZ DER KNOCHENMARKS-CHIMAEREN MAEUSE
58
5.10 VERRINGERTE UMSATZRATEN BESTIMMTER B-ZELL-POPULATIONEN IN
B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN 61
5.11 ERHOEHTE APOPTOSERATEN IN REIFEN UND UNREIFEN GRB2-DEFIZIENTEN
B-ZELLEN IN VITRO 63
5.12 BEEINTRAECHTIGTE HOCHREGULATION DES BAFF-REZEPTORS IN REIFEN
B-ZELLEN VON B-ZELL-
SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN 64
5.13 ERHOEHTE ZELLPROLIFERATION UNREIFER GRB2-DEFIZIENTER B-ZELLEN NACH
ANTI-LGM UND LPS-STIMULIERUNG 64
5.14 ERHOEHTES CALCIUMSIGNAL IN GRB2-DEFIZIENTEN PRIMAEREN B-ZELLEN 66
5.15 ERHOEHTE IGM-LMMUNGLOBULIN-LEVEL IM SERUM B-ZELL-SPEZIFISCHER
GRB2-/- MAEUSE 68
5.16 NORMALE MILZ-ARCHITEKTUR, ABER ERHOEHTE ZAHL IGM-POSITIVER
PLASMAZELLEN 68
5.17 REDUZIERTE LGG3-ANTWORT IN B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN NACH
IMMUNISIERUNG MIT TNP-FICOLL 70
5.18 UNVERAENDERTE THYMUS-ABHAENGIGE INNUNANTWORTEN IN B-ZELL-SPEZIFISCHEN
GRB2-/-
MAEUSEN GEGEN EIN PROTEIN-ANTIGEN 71
5.19 VERMINDERTE SEKUNDAERANTWORT IN B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN
NACH
IMMUNISIERUNG MIT VIRUSARTIGEN PARTIKELN 72
IMAGE 6
5.20 VERMINDERTE KEIMZENTRUMSBILDUNG IN DER MILZ VON B-ZELL-SPEZIFISCHEN
GRB2-/- MAEUSEN
NACH IMMUNISIERUNG MIT SCHAFS-ERYTHROZYTEN 73
6 DISKUSSION 74
6.1 DELETION DES GRB2-PROTEINS IN DEN MANIPULIERTEN MAEUSEN 74
6.2 EINFLUSS DER GRB2-DEFIZIENZ AUF DIE B-ZELL-ENTWICKLUNG 74
6.3 MECHANISTISCHE URSACHEN FUER DIE REDUZIERTEN B-ZELL-ZAHLEN IN DEN
B-ZELL-SPEZIFISCHEN GRB2-/- MAEUSEN 76
6.4 DER EINFLUSS VON GRB2 AUF DAS BZR-INDUZIERTE CALCIUMSIGNAL 78
6.5 DER EINFLUSS VON GRB2 AUF DIE MAP-KINASEN 79
6.6 GRB2 ALS AKTIVATOR VON AKT 80
6.7 EINFLUSS VON GRB2 AUF HUMORALE IMMUNANTWORTEN 81
6.7 ZUSAMMENFASSENDE BETRACHTUNG DER ROLLE VON GRB2 IN DER
B-ZELL-SIGNALLEITUNG 83
7 ZUSAMMENFASSUNG 86
8 SUMMARY
9 LITERATUR
10 ANHANG
87
88
97
10.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 97
10.2 LEBENSLAUF 102
10.3 PUBLIKATIONSLISTE 103
10.4 DANKSAGUNG 104
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