Untersuchungen zu Kinasen und deren Interaktion mit Hsp90 und Cdc37:
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| Format: | Thesis Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Verl. Dr. Hut
2011
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| Edition: | 1. Aufl. |
| Series: | Biochemie
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| Physical Description: | 169 S. Ill., graph. Darst. |
| ISBN: | 9783868537772 |
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNA
1.1 PROTEINE
1.2 PROTEINFALTUNG 1.2.1 PROTEINFALTUNQ IN VITRO 1.2.2 PROTEINFALTUNQ IN
VIVO
1.3 MOLEKULARE CHAOERONE
1.4 HSD90
1.4.1 STRUKTURELLER AUFBAU VON HSP90 1.4.2 ATPASE-AKTIVITAET VON HSD90
1.4.3 REQULATION DER HSP90-AKTIVITAET 1.4.3.1 CO-CHAPERONE
1.4.3.2 POSTTRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN 1.4.3.3 INHIBITOREN 1.4.4
HSD90-SUBSTRATPROTEINE 1.4.5 SUBSTRATPROTEINFALTUNA DURCH DEN
HSP70-HSP90-CHAPERON-ZVKLUS
1.5 PROTEINKINASEN
1.6 SRC-KINASEN 1.6.1 AUFBAU UND STRUKTUR VON SRC 1.6.2 UNTERSCHIEDE
ZWISCHEN C-SRC UND V-SRC 1.6.3 REQULATION DER SRC-KINASE 1.6.4
INTERAKTION MIT DEM HSO90-CHAPERONSVSTEM 1.6.5 SRC-SIQNALTRANSDUKTION
UND KREBS
1.7 ERBB-KINASEN 1.7.1 AUFBAU UND FUNKTION VON ERBB-KINASEN 1.7.2
ERBB-KINASEN UND KREBS 1.7.3 ERBB2-KINASE 1.7.4 INTERAKTION VON ERBB2
MIT HSO90
2. ZIELSETZUNA
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 MATERIAL 3.1.1 CHEMIKALIEN 3.1.2 PROTEINE UND ANTIKOERPER 3.1.3
GROESSENSTANDARDS UND KITS 3.1.4 CHROMATOQRAPHIEMATERIALIEN UND -SAEULEN
3.1.5 ZELLKULTURAUSSTATTUNQ 3.1.6 SONSTIAE MATERIALIEN 3.1.7 GERAETE
3.1.8 COMDUTERPROQRAMME
3.2 MIKROBIOLOQISCHE UND MOLEKULARBIOLOQISCHE METHODEN 3.2.1
BAKTERIENSTAEMME 3.2.2 HEFESTAEMME 3.2.3 ANTIBIOTIKA UND MEDIEN 3.2.4
KULTIVIERUNQ UND LAQERUNQ VON E.COLI 3.2.5 KULTIVIERUNQ UND LAQERUNQ VON
HEFE-ZELLEN 3.2.6 HERSTELLUNQ CHEMISCH-KOMPETENTER E.COLI ZELLEN 3.2.7
PUFFER UND LOESUNGEN FUER MOLEKULARBIOLOOISCHE METHODEN 3.2.8
OLIQONUKLEOTIDE 3.2.9 PLASMIDE 3.2.10 PCR-AMPLIFIKATION 3.2.11
AUFTRENNUNQ VON DNA DURCH AAAROSE-GELELEKTROPHORESE 3.2.12 REINIQUNQ VON
PCR-PRODUKTEN UND DNA-FRAQMENTEN 3.2.13 DNA-ISOLIERUNQ AUS AOAROSEQELEN
3.2.14 RESTRIKTIONSVERDAU 3.2.15 DEPHOSPHORYLIERUNQ VON DNA-ENDEN
1
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BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1010075276
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.16 LIGATION 62
3.2.17 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN ECO/ZZELLEN 62
3.2.18 TRANSFORMATION VON PLASMIDEN IN DHIOBAC E.CO//ZELLEN 62
3.2.19 TRANSFORMATION VON S. CEREVISIAE 63
3.2.20 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS E.COLI 63
3.2.21 PRAEPARATION VON BACMID-DNA 63
3.2.22 BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 64
3.2.23 DNA SEQUENZANALYSE 64
3.3 ZELLKULTURTECHNIKEN 64
3.3.1 ZELLLINIE UND -MEDIUM 64
3.3.2 KULTIVIERUNG VON INSEKTENZELLEN 64
3.3.2.1 INITIIERUNG VON KULTUREN MIT GEFRORENEN ZELLEN 64
3.3.2.2 KULTIVIERUNG VON MONOLAYERKULTUREN 65
3.3.2.3 INITIIERUNG VON FLUESSIGKULTUREN 65
3.3.2.4 KULTIVIERUNG VON FLUESSIGKULTUREN 65
3.3.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL UND VIABILITAET 66
3.3.4 LANGZEITLAGERUNG VON INSEKTENZELLEN 66
3.3.5 TRANSFEKTION VON INSEKTENZELLEN MIT BACMID-DNA ZUR HERSTELLUNG VON
REKOMBINANTEN BACULOVIREN 67
3.3.6 VIRUS-AMPLIFIKATION 67
3.4 METHODEN ZUR PROTEINEXPRESSION 67
3.4.1 EXPRESSIONSKINETIK IN E.COLI 67
3.4.2 EXPRESSIONSKINETIK IN SF9-ZE EN 68
3.4.3 ANZUCHT, EXPRESSION UND ERNTE VON ECO/Z-ZELLEN 69
3.4.4 ANZUCHT, EXPRESSION UND ERNTE VON S/9-ZELLEN 69
3.4.5 ZELLAUFSCHLUSS 69
3.5 PROTEINREINIGUNGSMETHODEN 70
3.5.1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 70
3.5.2 LONENAUSTAUSCHCHROMATOGRAPHIE 71
3.5.3 GELFILTRATIONSCHROMATOGRAPHIE 71
3.5.4 PROTEINPRAEZIPITATION 71
3.5.5 KONZENTRIERUNG VON PROTEINEN 72
3.5.6 PROTEINDIALYSE 72
3.5.7 STANDARDREINIGUNG VON HIS-GETAGGTEN PROTEINEN AUS E.COLI 72
3.5.8 REINIGUNG VON CSRC- UND VSRC-KINASE AUS E.COLI 73
3.5.9 REINIGUNG VON CSRC- UND VSRC-KINASE AUS SW-ZELLEN 74
3.6 PROTEINBIOCHEMISCHE UND ANALYTISCHE METHODEN 75
3.6.1 PUFFER UND LOESUNGEN 75
3.6.2 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 76
3.6.3 COOMASSIE-FAERBUNG VON SDS-GELEN 76
3.6.4 IMMUNOBLOTTING (WESTERN BLOT) 77
3.6.5 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG MITTELS BRADFORD 77
3.6.6 ANALYTISCHE GELFILTRATION 78
3.7 SPEKTROSKOPISCHE METHODEN 79
3.7.1 UV/VIS-SPEKTROSKOPIE 79
3.7.2 FLUORESZENZ-SPEKTROSKOPIE 80
3.7.3 CIRCULARDICHROISMUS-SPEKTROSKOPIE 81
3.7.4 LICHTSTREUUNG 83
3.8 PROTEIN-PROTEIN-INTERAKTIONSASSAYS 84
3.8.1 PLASMON-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE (BIACORE) 84
3.8.2 IMMUNOPRAEZIPITATION 84
3.9 AKTIVITAETSASSAYS 85
3.9.1 KINASEASSAY MIT I^PI-VATP IN VITRO 85
3.9.2 REAKTIVIERUNGSASSAY 85
3.9.3 IN VIVO SRC-AKTIVITAETSASSAY IN HEFE 86
4. ERGEBNISSE 88
IMAGE 3
INHALTSVERZEICHNIS
4.1 ETABLIERUNG DES BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEMS 88
4.1.1 TRANSFORMATION VON DH10BAC-ECO/ABAKTERIEN ZUR HERSTELLUNG VON
REKOMBINANTER BACMID-DNA 88
4.1.2 TRANSFEKTION VON S/9-ZELLEN ZUR HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEN
BACULOVIREN 89 4.1.3 VIRUS-AMPLIFIKATION 90
4.1.4 TESTEXPRESSION VON C-SRC UND V-SRC IN S/9-ZELLEN 91
4.2 EXPRESSION UND REINIGUNG VON SRC-KINASEN 92
4.2.1 EXPRESSION UND REINIGUNG IN S/9-ZELLEN 92
4.2.2 ALTERNATIVE ANZUCHTS- UND EXPRESSIONSMETHODEN ZU PRODUKTION DER
SRC-KINASEN 94 4.2.3 PHOSPHORYLIERUNGSSTATUS DER C-SRC- UND V-SRC-KINASE
96
4.3 CHARAKTERISIERUNG GEREINIGTER SRC-KINASEN 97
4.3.1 PHOSPHORYLIERUNGSAKTIVITAET DER SRC-KINASEN 99
4.3.2 THERMISCHE STABILITAET 100
4.3.3 THERMISCHEINAKTIVIERUNG 102
4.3.3.1 INAKTIVIERUNG AUS SF9-ZELLEN GEREINIGTER V-SRC- UND C-SRC-KINASE
102 4.3.3.2 INAKTIVIERUNG AUS SF9-ZELLEN GEREINIGTER C-SRC MUTANTEN 103
4.3.3.3 INAKTIVIERUNG AUS E.COLI GEREINIGTER V-SRC- UND C-SRC-KINASE 105
4.4 INTERAKTION MIT CHAPERONEN UND CO-CHAPERONEN 106
4.4.1 CHARAKTERISIERUNG DER S13E-MUTANTE VON HCDC37 107
4.4.1.1 STRUKTURELLE EIGENSCHAFTEN 107
4.4.1.2 PHOSPHORYLIERUNG VON HCDC37 108
4.4.1.3 FUNKTIONELLE EIGENSCHAFTEN 109
4.4.2 BINDUNG VON CHAPERONEN AN V-SRC 110
4.4.2.1 IMMUNPRAEZIPITATIONEN 110
4.4.2.2 BIACORE-MESSUNGEN 110
4.4.3 EINFLUSS VON HSP90 UND CDC37 AUF DIE STABILITAET DER C-SRC- UND
V-SRC-KINASE 111 4.4.4 EINFLUSS VON CHAPERONEN UND CO-CHAPERONEN AUF DIE
KINASEAKTIVITAET 112 4.4.5 REAKTIVIERUNG VON INAKTIVIERTER SRC-KINASE 114
4.4.6 STABILISIERUNG DER AKTIVITAET VON C-SRC UND V-SRC DURCH CHAPERONE
BEI ERHOEHTEN TEMPERATUREN 116
4.4.6.1 EINFLUSS VON HSP90 AUF DIE INAKTIVIERUNG AUS S/9-ZELLEN
GEREINIGTER V-SRC- UND C- SRC-KINASE 116
4.4.6.2 EINFLUSS VON HCDC37S13E AUF DIE INAKTIVIERUNG AUS S/9-ZELLEN
GEREINIGTER V-SRC- KINASE 117
4.4.6.3 EINFLUSS VON HHSP90 AUF DIE INAKTIVIERUNG VON AUS E.COLI
GEREINIGTER V-SRC- UND C- SRC-KINASE 118
4.4.6.4 EINFLUSS VON HCDC37WT BZW. HCDC37S13E AUF DIE INAKTIVIERUNG VON
AUS E.COLI GEREINIGTER V-SRC-KINASE 119
4.4.6.5 EINFLUSS VON HSP70 AUF DIE INAKTIVIERUNG VON AUS E.COLI
GEREINIGTEM V-SRC 121 4.4.6.6 EINFLUSS WEITERER CO-CHAPERONE AUF DIE
INAKTIVIERUNG DER V-SRC-KINASE 122 4.4.7 STABILISIERUNG DER
KINASEINAKTIVIERUNQ VON V-SRC DURCH ATP 123
4.5 EINFLUSS VON HSP90 AUF C-SRC, C-SRC-MUTANTEN UND V-SRC IN VIVO 124
4.5.1 IN V/VO-SRC-VIABILITAETSASSAY 124
4.5.2 EINFLUSS VON MACBECIN AUF DIE SRC-AKTIVITAET IN VIVO 126
4.6 VERGLEICH DER KINASEDOMAENEN DES HSP90-ABHAENGIGEN ERBB2 WILDTYPS UND
DER HSP90-UNABHAENGIGEN 5M-MUTANTE 127
4.6.1 STRUKTURELLER VERGLEICH 128
4.6.2 STABILITAET 129
4.6.3 FLUORESZENZMESSUNGEN 130
5. DISKUSSION 132
5.1 SRC-EXPRESSION IM BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM 132
5.2 VERGLEICH DER STABILITAET VON C-SRC, V-SRC UND C-SRC-MUTANTEN 134
5.2.1 AKTIVITAET VON C-SRC, V-SRC UND C-SRC-MUTANTEN 134
5.2.2 THERMISCHE STABILITAET 135
5.2.3 THERMISCHE INAKTIVIERUNG VON C-SRC, V-SRC UND C-SRC MUTANTEN 1 37
5.3 STABILISIERUNG DER V-SRC- UND C-SRC-KINASE DURCH CHAPERONE 138
IMAGE 4
INHALTSVERZEICHNIS
5.3.1 EINFLUSS AUF DIE KINASEAKTIVITAET 138
5.3.2 REAKTIVIERUNG VON INAKTIVIERTER SRC-KINASE DURCH EINEN
CHAPERON-MIX 139 5.3.3 EINFLUSS VON CHAPERONEN AUF DIE
HITZEINAKTIVIERUNG DER C-SRC- UND V-SRC-KINASE 140 5.3.4 IN
V/VO-VIABILITAETSASSAYS MIT C-SRC, V-SRC UND C-SRC MUTANTEN 142
5.4 VERGLEICH DER KINASEDOMAENEN VON ERBB2-WT UND ERBB2-5M 144
5.5 SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK 144
6. ZUSAMMENFASSUNG 147
7. LITERATUR 149
8. ANHANG 166
|
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| spelling | Reefschläger, Lasse Gunnar Verfasser aut Untersuchungen zu Kinasen und deren Interaktion mit Hsp90 und Cdc37 Lasse Gunnar Reefschläger 1. Aufl. München Verl. Dr. Hut 2011 169 S. Ill., graph. Darst. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Biochemie Zugl.: München, Techn. Univ., Diss., 2010 Kinasen (DE-588)4268693-3 gnd rswk-swf Hitzeschock-Proteine (DE-588)4255487-1 gnd rswk-swf Wechselwirkung (DE-588)4064937-4 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Kinasen (DE-588)4268693-3 s Hitzeschock-Proteine (DE-588)4255487-1 s Wechselwirkung (DE-588)4064937-4 s DE-604 DNB Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=021184565&sequence=000001&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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