Einfluss von S-Lost und alkylierenden Substanzen (Chemotherapeutika) auf Wundheilungsmechanismen: = Influence of S-Lost and alkylating agents (chemotherapeutic agents) on wound healing mechanism
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Bonn
Streitkräfteamt, Abt. 3, Fachinformationszentrum der Bundeswehr
2010
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Autor: Bloch, Wilhelm
Jahr: 2010
1 ZUSAMMENFASSUNG..................................................................................................................................2-
2 SUMMARY.................................................................................................................................................-4-
3 ABKÜRZUNGS- / DEFINITIONSVERZEICHNIS_______._________.... ...............___,................_..................... - 8 -
4 EINLEITUNG....................... ................................................................................................. ........................1
5 FRAGESTELLUNG............................................................................................................................................5
6 MATERIAL METHODEN........................................................... ...................................................................7
6.1 Methoden.........................................................................................................................................................7
Zellbiologische Methoden........................................................................,...................................................,.............7
6.1.1.1 Zellkultur............................................................................................................................................................7
6.1.1.1.1 Auftauen von kryokonservierten Zellen........................................................................................................7
6.1.1.1.2 Gewinnung von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)...... ......................................................................7
6.1.1.1.3 Kultivierung und Trypsinierung der Feederzellen........................................................................................8
6.1.1.1.4 Inaktivierung von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF).......................................................................8
6.1.1.1.5 Kultivierung der embryonalen Stammzellen................................................................... ..............................9
6.1.1.1.6 Dissoziation/Vorbereitung zur Erzeugung hängender Tropfen................................................*...................9
6.1.1.1.7 Erzeugung der hängenden Tropfen.............................................................................................................10
6.1.1.1.8 Abspülen der hängenden Tropfen......................................................................................... ...................11
6.1.1.1.9 Gelatinebeschichtung der Multiwellplatten................................................................................................11
6.1.1.1.10 Plattierung der Embryoid Bodies (Eßs).......................................................................................................11
6.1.1.1.11 Behandlung der EB......................................................................................................................................12
Magnet-associated cell sorting (MACS).....,.............................................................................................................13
6.1.1.2 Mini-MACS-System...........................................................................................................................................13
6.1:1.3 Reinheit MACS-sortierterEndothelzellen.........................................................................................................14
Kultivierung D3 undMACS-sortierterEndothelzellen..............................................................................................14
Isolation1 und Kultivierung von £P£s...s....*.;.....i........;..................................;......................................;. .....................14
6-Galactosidase-Färbung.........................;..............................................................................................................36
Immunzytochemie............................................................;......................................................................................19
6.1.1.4 Prinzip der Immunzytochemie..........................................................................................................................19
6.1.1.5 Detektion des Antikörpers........................................................................¦......................................-..................20
Intervention.............................................................................................................................................................20
6.1.1.6 Intervention mit ct-Linolensäure bzw. N-Acetylcystein (NAC)..........................................................................20
Hemmungen von Signaltransduktionswegen..........................................................................:...............................21
6.1.1.7 Hemmung des PI3K-Signalweges......................................................................................................................21
6.1.1.8 Hemmung der Apoptose..................................................................................................................................21
Lebendzellbeobachtung - Wundheilungsassay.......................................................................................................21
Untersuchung der Bildung von NO und freien Radikalen........................................................................................22
6.1.1.9 NO-Messung über Diaminofluorescein (DAF)-Fluorometrie................................,...........................................22
6.1.1.10 Nachweis reaktiver Sauerstoffmetabolite- reactive oxygen species (ROS).....................................................22
6.1.1.11 Synchrone in situ Detektion von ROS und RNS................................................................................................23
Statistik 23
6.2 Material.........................................................................................................................................................24
Lösungen, Medien und Puffer..................................................................................................................................24
Antikörper................................................................................................................................................................25
7 ERGBENISSE.................................................................................................................................................27
7.1 Chlorambucil-Behandlung..............................................................................................................................27
Analyse der Vaskulo- und Angiogeneseprozesse am EB-Modell..............................................................................27
Morphologie der EBs...............................................................................................................................................27
Gefäßentwicklung....................................................................................................................................................30
Proliferation.............................................................................................................................................................35
Apoptose 40
Wundheilungsassay.................................................................................................................................................44
6-Galactosidase-Färbung........................................................................................................................................46
Immunhistochemie und Intervention.......................................................................................................................48
7.1.1.1 Intervention mit a-Unolensäure bzw. N-Acetylcystein (NAC)................................... .....................................48
7.1.1.2 Hemmung von Signaltransduktionswegen.......................................................................................................59
7.1.1.2.1 Einfluss einer PI3K-Hemmung auf die Signaltransduktion..........................................................................59
7.1.1.2.2 Exogene Hemmung der Apoptose..............................................................................................................63
Bildung von NO und freien Radikalen........................................................................................,............... ............66
7.1.1.3 NO-Messung über Diaminofluorescein (DAF)-Fluorometrle............................................................................66
7.1.1.4 Nachweis reaktiver Sauerstoffmetabolite - reactive oxygen species (ROS).....................................................71
7.2 CEES-Behandlung...........................................................................................................................................81
Analyse der Vaskulo- und Angiogeneseprozesse am EB-Modell...........................:...................................... .:.........81
Morphologie der EBs......,...............................................................................,........................................................81
Gefäßentwicklung....................................................................................................................................................83
Proliferation.............................................................................................................................................................85
Apoptose.................................................................,....................................................,..................... .. ......,.:......86
6-Galactosidase-Färbung........................................................................................................................................88
Wundheilungsassay......................................................................................................,..........................................90
Immunhistochemie und Intervention................................................................................................................;......92
Intervention mit a-Linolensäure bzw. N-Acetylcystein (NAC)...........................................,......................................92
Bildung von NO und Freien Radikalen.................................................................................,,...................,...............98
7.3 S-lost-Behandlung.........................................................................................................................................99
Analyse der Vaskulo- und Angiogeneseprozesse am EB-Modell.........,........................................ .,........................99
Morphologie der EBs......................................................................................................................i.......................99
Geßßentwicklung..................................................................................................................................................101
Proliferation..................................................................................................................;..........................:.............206
Apoptose........................................................................................................................;......................................109
Immunhistochemie und Intervention..............................................,........................:......................:.. ....................113
Intervention mit a-Linolensäure bzw. N-Acetylcystein (NAC)................................................................................114
8 DISKUSSION DER ERGEBNISSE.......................................................................................................,..... .......122
8.1 Veränderung der frühen vaskulären Entwicklung durch das N-alkylierende Arzneimittel Chlorambucil-
mögliche rolle im wundheilungsprozeß.............................................,...,.»......,...........................................................126
8.2 Die Chlorambucil-induzierte Hemmung der endothelialen Migration ist der Schlüsselmechanismus für die
Hemmung der Gefäsentwicklung.......................................................................................,.........»... ............,.*..,........ 127
.8.3 Klinische Bedeutung der Chlorambucil Wirkung auf die Gefäbentwicklung...................................................131
8.4 mögliche Rolle von Chlorambucil auf die Regeneration des Endothels in vorhandenen Gefäben a.................132
8.5 Zusammenfassung und möguche zukünftige Perspektive.............................................................*.................132
9 PROJEKTERGEBNISSE IM BEZUG ZU DEN ZIELEN DES PROJEKTS................................................................... 133
10 LITERATURVERZEICHNIS............................................................................................................................137
11 ANHANG....................................................................................................................................................144
11.1 Western Blots...............................................................................................................................................144
11.2 Migration.....................................................................................................................................................149
11.2.1 Migration der Zellen aus den Embyoid Body..........................................................................................149
11.2.2 Migration MACS-sortierter Endothelzellen............................................................................................150
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