Immunomagnetische Anreicherung von Mikroorganismen und ihre bioanalytische Quantifizierung:
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München
Verl. Dr. Hut
2010
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| Series: | Analytische Chemie
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG 1
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 7
2.1 MIKROORGANISMEN IM WASSER 8
2.1.1 RELEVANTE KEIME UND GESETZLICHE BESTIMMUNGEN 8
2.1.2 ENTEROBACTERIACEAE 10
2.1.3 ESCHERICHIA COLI 11
2.2 ANREICHERUNG VON BAKTERIEN DURCH IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION
(IMS)... 12
2.2.1 ALLGEMEINES 12
2.2.2 ANTIKOERPER 13
2.2.3 GRUNDLAGEN DES MAGNETISMUS 15
2.2.4 FLUIDDYNAMISCHE GRUNDLAGEN 18
2.2.5 ANWENDUNGEN DER IMS 20
2.2.6 IMS GROSSER PROBENVOLUMINA 20
2.2.7 UEBERBLICK KOMMERZIELL ERHAELTLICHER PRODUKTE 22
2.2.7.1 MAGNETISCHE PARTIKEL 22
2.2.7.2 MAGNETISCHE SEPARATOREN 23
2.2.8 IMMUNOMAGNETISCHE ANREICHERUNG VON MIKROORGANISMEN 24 2.2.9
GRUPPENSPEZIFISCHE ANREICHERUNG DER ENTEROBACTERIACEAE 26 2.2.9.1
ENTEROBAKTERIELLES GEMEINSAMES ANTIGEN 26
2.2.9.2 ENDOTOXINE 27
2.2.10 WEITERE ANREICHERUNGSVERFAHREN FUER MIKROORGANISMEN 28 2.2.10.1
DRUCKGETRIEBENE MEMBRANVERFAHREN 29
2.2.10.2 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 30
2.2.10.3 ANDERE VERFAHREN 32
2.3 MAGNETISCHE NANOPARTIKEL (MNPS) 33
2.3.1 HERSTELLUNG UND FUNKTIONALISIERUNG 33
2.3.2 ANWENDUNGEN 34
2.3.3 CHARAKTERISIERUNG 36
2.4 DETEKTION VON MIKROORGANISMEN 37
2.4.1 KLASSISCHE MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 37
2.4.2 BIOANALYTISCHE METHODEN 38
2.4.2.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 39
2.4.2.2 DNA-BASIERTE METHODEN 44
2.4.2.3 IMMUNANALYTISCHE METHODEN UND BIOSENSOREN 47
2.4.2.4 COLILERT-18/QUANTI-TRAY/2000 49
2.4.3 MIKROARRAYS 50
2.4.3.1 ALLGEMEINES 50
2.4.3.2 OBERFLAECHEN 50
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/1009330101
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
2.4.3.3 STRUKTURIERUNG VON CHIPOBERFLAECHEN MIT ANTIGENEN UND ANTIKOERPERN
51
2.4.3.4 MIKROARRAY-FORMATE 52
3 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 56
3.1 ZELL-MIKROARRAYS ZUR UNTERSUCHUNG VON ANTIKOERPERN 56
3.1.1 HERSTELLUNG DER MIKROARRAYS: OBERFLAECHENCHEMIE 57
3.1.2 INAKTIVIERUNG DER ZELLEN 60
3.1.3 IMMOBILISIERUNG DER ZELLEN UND ANTIGENE AUF DEN MIKROARRAY-CHIPS
60 3.1.4 MESSUNGEN MIT DEM MIKROARRAY-AUSLESEGERAET 61
3.1.4.1 ZELL-MIKROARRAY MIT LEBENDEN E. CO//-ZELLEN 61
3.1.4.2 VERGLEICH DER SIGNALINTENSITAETEN FUER UNTERSCHIEDLICHE
OBERFLAECHEN 62 3.1.4.3 AFFINITAET DER GETESTETEN ANTIKOERPER ZU
UNTERSCHIEDLICHEN ANTIGENEN 63 3.2 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION 72
3.2.1 PROJEKTBEDINGTE ANFORDERUNGEN 72
3.2.2 VERSUCHE MIT KOMMERZIELL ERHAELTLICHEN MAGNETISCHEN PARTIKELN UND
SAEULEN 73 3.2.3 ANREICHERUNG VON . COLI AUS PROBENVOLUMINA VON 50 ML 77
3.2.3.1 IMMUNOMAGNETISCHE MARKIERUNG DER ZELLEN IN 1 ML 78
3.2.3.2 IMMUNOMAGNETISCHE MARKIERUNG DER ZELLEN IN 50 ML 79
3.2.3.3 VORLAGE DER IMS-PARTIKEL AUF DER MAGNETISCHEN SAEULE 81
3.2.3.4 VERWENDUNG MAGNETISCHER SAEULEN MIT DRAHTNETZEN 84
3.3 MAGNETISCHE PARTIKEL 86
3.3.1 SYNTHESE UND FUNKTIONALISIERUNG CARBOXY-PEG-UMHUELLTER
MAGNETIT-MNPS 86 3.3.1.1 HERSTELLUNG 86
3.3.1.2 PARTIKELCHARAKTERISIERUNG 87
3.3.1.3 KOPPLUNG DER MNPS AN ANTIKOERPER MITTELS EDC-/NHS-CHEMIE UND
PROTEINBESTIMMUNG 88
3.3.2 SYNTHESE UND FUNKTIONALISIERUNG SILANISIERTER MAGNETIT-MNPS 91
3.3.2.1 HERSTELLUNG 91
3.3.2.2 KOPPLUNG DER MNPS AN ANTIKOERPER 92
3.3.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER MNPS 93
3.3.3 ANREICHERUNG VON E. CO//-ZELLEN AUS 10-ML-PROBEN MIT ANTI-ECA-MNPS
96
3.4 NACHWEIS UND QUANTIFIZIERUNG ANGEREICHERTER BAKTERIEN 96
3.4.1 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 97
3.4.2 COLILERT-18/QUANTI-TRAY 2000 99
3.4.3 QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR (QRT-PCR) 100
3.4.4 CHEMILUMINESZENZ-SANDWICH-ELISA 101
3.4.4.1 TITRATION DER BENOETIGTEN MENGE AN ANTI-ECA-MNPS 102
3.4.4.2 AFFINITAETSUNTERSUCHUNG DER VERWENDETEN ANTIKOERPER 103 3.4.4.3
CHEMILUMINESZENZ-SANDWICH-ELISA 106
3.4.4.4 UNTERSUCHUNG DER LAGERSTABILITAET ANTIKOERPER-GEKOPPELTER MNPS 111
3.4.5 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 111
3.4.6 DETEKTION VON BAKTERIENZELLEN MITTELS ANTIKOERPER-MIKROARRAYS 112
3.4.6.1 DETEKTION IMMUNOMAGNETISCH ANGEREICHERTER, LEBENDER F.
CO//-ZELLEN 112
II
IMAGE 3
4 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 116
5 EXPERIMENTELLER TEIL 122
5.1 VERWENDETE GERAETE 122
5.2 VERBRAUCHSMATERIALIEN 124
5.3 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN 125
5.3.1 CHEMIKALIEN 125
5.3.2 BAKTERIENSTAEMME 127
5.3.3 BAKTERIELLE ANTIGENE 127
5.3.4 ANTIKOERPER UND IMMUNCHEMISCHE REAGENZIEN 128
5.3.5 BIOCHEMISCHE REAGENZIEN 129
5.3.6 PUFFER UND LOESUNGEN 130
5.4 STANDARDPROZEDUREN ....131
5.4.1 MIKROARRAYS 131
5.4.1.1 HERSTELLUNG VON DAPEG-MIKROARRAYS 131
5.4.1.2 OBERFLAECHENMODIFIKATION VON DAPEG-MIKROARRAYS 133 5.4.1.3
INAKTIVIERUNG VON ZELLEN 134
5.4.1.4 IMMOBILISIERUNG VON ZELLEN UND ANTIKOERPERN AUF DEN
MIKROARRAY-CHIPS 134 5.4.1.5 MESSUNGEN MIT DEM MIKROARRAY-AUSLESEGERAET
135
5.4.2 MAGNETISCHE NANOPARTIKEL (MNP) 138
5.4.2.1 HERSTELLUNG 138
5.4.2.2 CHARAKTERISIERUNG 140
5.4.2.3 PROTEINBESTIMMUNG 140
5.4.3 IMMUNOMAGNETISCHE SEPARATION VON E. COLI 141
5.4.3.1 IMS VON E. CO//-ZELLEN MIT KOMMERZIELL ERHAELTLICHEN
STREPTAVIDIN-GEKOPPELTEN PARTIKELN UND BIOTIN-KONJUGIERTEN PAKANTI-F.
COLI 141
5.4.3.2 IMS VON E. CO//-ZELLEN AUS 10-ML-PROBEN MIT ANTI-ECA-MNPS UND
AUTOMACS- SAEULEN 143
5.4.4 MIKROBIOLOGISCHE UND MOLEKULARBIOLOGISCHE TECHNIKEN 144 5.4.4.1
ALLGEMEINES 144
5.4.4.2 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 144
5.4.4.3 PHOTOMETRISCHE ABSCHAETZUNG VON ZELLKONZENTRATIONEN 145 5.4.4.4
DU RCHFLUSSZYTOMETRIE 145
5.4.4.5 COLILERT-18/UEUANTI-TRAY 2000 145
5.4.4.6 QUANTITATIVE ECHTZEIT-PCR 146
5.4.4.7 CHEMILUMINESZENZ-SANDWICH-ELISA 147
5.4.4.8 CHROMOGENER SANDWICH-ELISA 148
5.4.4.9 CHROMOGENER ELISA MIT IMMOBILISIERTEN E. CO/F-ZELLEN 148
5.4.4.10 FLUORESZENZMIKROSKOPIE 149
6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 152
IMAGE 4
7 LITERATURVERZEICHNIS 158
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