Wilms Tumor Gen WT1 als molekularer Marker von akuten und chronischen Leukämien:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
München
AVM
2010
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IMAGE 1
1 EINLEITUNG 1
1.1 LEUKAEMIEN UND MINIMALE RESTERKRANKUNG 1
1.1.1 AKUTE UND CHRONISCHE LEUKAEMIEN 1
1.1.1.1 AKUTE LYMPHATISCHE LEUKAEMIE (ALL) 2
1.1.1.2 AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE (AML) 3
1.1.1.3 CHRONISCH MYELOISCHE LEUKAEMIE (CML) 4
1.1.2 MINIMALE RESTERKRANKUNG (MRD) 5
1.1.3 BEDEUTUNG DER VERLAUFSDIAGNOSTIK VON MRD 6
1.1.4 ETABLIERTE VERLAUFSPARAMETER DER MRD UND RELEVANZ KLONALER MARKER
7 1.2 ETABLIERTE VERFAHREN UND ZIELSTRUKTUREN ZUR MRD-VERLAUFSDIAGNOSTIK
8 1.2.1 ZYTOMORPHOLOGIE IM KNOCHENMARK UND DIFFERENTIALBLUTBILD 8
1.2.2 ZYTOGENETIK 9
1.2.3 FLUORESZENZ-LN-SITU-HYBRIDLSIERUNG (FISH) 10
1.2.4 NORTHERN UND SOUTHERN BLOTTING 10
1.2.5 IMMUNPHAENOTYPLSIERUNG ZUM NACHWEIS LEUKAEMIE-ASSOZIIERTER
PHAENOTYPEN 11 1.2.6 POLYMERASEKETTENREAKTION (RT-PCR) ZUM NACHWELS
KLONALER MARKER 11 1.2.6.1 PRINZIP DER KONVENTIONELLEN
POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 13 1.2.6.2 NESTED-PCR 15
1.2.6.3 SEMI-QUANTITATIVE PCR 15
1.2.6.4 QUANTITATIVE KOMPETITIVE PCR 16
1.3 LIMLTATIONEN ETABLIERTER VERFAHREN ZUR VERLAUFSDIAGNOSTIK VON MRD 17
1.4 WILMS TUMOR GEN (WT1) 17
1.4.1 IDENTIFIKATION, KLONIERUNG, GENEXPRESSION 17
1.4.2 BEDEUTUNG UND FUNKTION VON WT1 19
1.4.3 NACHWEIS UND BEDEUTUNG VON WT1 IN DER NORMALEN HAEMATOPOESE 21
1.4.4 NACHWEIS UND BEDEUTUNG VON WT1 BEI LEUKAEMIEN 21
1.4.5 WT1 ALS PROGNOSTISCHER MARKER UND KLINISCHER VERLAUFSPARAMETER VON
MRD23 1.4.6 MOEGLICHKEITEN VON WT1 ALS ZIELPROTEIN BEI IMMUNTHERAPIEN 24
2 FRAGESTELLUNG 25
3 PATIENTENPROBEN, MATERIAL, METHODEN 26
3.1 UNTERSUCHUNGSKOLLEKTIV 26
3.1.1 PATIENTENKOLLEKTIV 26
3.1.2 KONTROLLKOLLEKTIV 26
3.2 MATERLALLEN 27
3.2.1 CHEMIKALIEN, REAGENZIEN, ENZYME UND KITS 27
3.2.2 REZEPTE FUER PUFFER UND LOESUNGEN 28
3.2.3 PUFFER UND LOESUNGEN DER KITS 30
3.2.3.1 PUFFER ZUR GELEXTRAKTION (QIAQUICKGEL EXTRACTION KIT) 30 3.2.3.2
PUFFER ZUR PLASMIDEXTRAKTLON (QIAPREP MINIPREP PLASMLDEXTRAKTION KIT)
.30 3.2.3.3 PUFFER ZUR KLONIERUNG (TOPO TA CLONING KIT) 30
3.2.4 RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN UND PUFFER 31
3.2.5 ZELLEN UND ZELLKULTURMEDIEN 31
3.2.6 PCR REAGENZIEN 33
3.2.6.1 REAGENZIEN FUER DIE KONVENTIONELLE PCR 33
3.2.6.2 REAGENZIEN FUER DIE REALTIME-PCR 33
3.2.6.3 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 34
3.2.6.3.1 PRIMER 34
3.2.6.3.2 TAQMAN-SONDEN 35
3.2.6.3.3 LIGHTCYCLER^-SONDEN 35
3.2.7 GERAETE UND VERBRAUCHSMATERIALEN 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN HTTP://D-NB.INFO/100869133X
DIGITALISIERT DURCH
IMAGE 2
3.2.7.1 PCR-ZYKLER 35
3.2.7.2 WEITERE GERAETE 36
3.2.7.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN 36
3.2.8 COMPUTER SOFTWARE-PROGRAMME 37
3.3 METHODEN 37
3.3.1 PROBENAUFARBEITUNG 37
3.3.1.1 BLUTAUFARBEITUNG 37
3.3.1.2.DEXTRANSEPARIERUNG 37
3.3.1.3 RNS-ISOLIERUNG AUS LEUKOZYTEN 38
3.3.2 REVERSE-TRANSKRIPTION 39
3.3.3 RNS-KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 39
3.3.4 KONVENTIONELLE POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 40
3.3.4.1 ANSATZ FUER EINE KONVENTIONELLE PCR 40
3.3.4.2 BEDINGUNGEN FUER DIE KONVENTIONELLE PCR 41
3.3.4.3 AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 41
3.3.5 REALTIME-PCR-VERFAHREN 42
3.3.5.1 REALTIME-PCR IM TAQMAN-FORMAT 42
3.3.5.1.1 REALTIME-PCR-ANSATZ(TAQMAN-FORMAT) 45
3.3.5.1.2 REALTLME-PCR-ZYKLUSBEDLNGUNGEN(TAQMAN-FORMAT) 45 3.3.5.2
REALTIME-PCR AUF DEM LIGHTCYCLER 45
3.3.5.2.1 REALTIME-PCR-ANSATZ(LIGHTCYCLER-FORMAT) 47 3.3.5.2.2
REALTIME-PCR-ZYKLUSBEDINGUNGENILIGHTCYCLE^-FORMAT) 47 3.3.5.3 PRIMER-
UND SONDENDESIGN 47
3.3.5.3.1 LAGE DER VERWENDETEN PRIMER UND SONDEN 49
3.3.5.4 REFERENZGENE 49
3.3.5.5 ERSTELLEN EINER STANDARDREIHE FUER DIE REALTIME-PCR 50 3.3.5.5.1
KLONIERUNG ZUR PLASMIDGEWINNUNG 50
3.3.5.5.2 PLASMLDEXTRAKTION 53
3.3.5.5.3 RESTRIKTIONSVERDAU 54
3.3.5.5.4 GELEXTRAKTION MIT AUFREINIGUNG DES STANDARDPRODUKTES 54
3.3.5.5.5 AMPLIFIKATION DES STANDARDS MITTELS UNSPEZIFISCHER PCR 55
3.3.5.5.6 BERECHNUNG DER KOPIENZAHL DES STANDARDS 55
3.3.5.5.7 HERSTELLUNG EINER VERDUENNUNGSREIHE DES STANDARDS 56 3.3.6
STATISTIK 56
4 ERGEBNISSE 57
4.1. WT1 -STANDARDREIHE DER REALTIME-PCR 57
4.1.1 WT1-STANDARDREIHE DER REALTIME-PCR NACH GELELEKTROPHORESE 57 4.1.2
LINEARER AMPLIFIKATIONSPLOT DER WT1-STANDARDREIHE NACH REALTIME-PCR 58
4.1.3 WT1-STANDARD-ELCHKURVE DER REALTIME-PCR 59
4.2 WT1-MRNS-EXPRESSION BEI ERSTDIAGNOSE BEI VERSCHIEDENEN LEUKAEMIEN 60
4.3 WT1 ALS KLONALER MARKER FUER DIE MRD-VERLAUFSDIAGNOSTIK 61
4.3.1 MRD-VERLAUFSBEOBACHTUNGEN MITTELS WT1-MRNS-EXPRESSION M TAQMAN-
FORMAT 62
4.3.1.1 WT1-MRNS-EXPRESSIONINAML 62
4.3.1.2 WT1-MRNS-EXPRESSLON IN ALL 63
4.3.1.3 WTI-MRNS-EXPRESSION IN CML 64
4.3.1.3.1 WT1-MRNS-EXPRESSION IN CML NACH ALLOGENER KMT 64 4.3.1.3.2
WT1-MRNS-EXPRESSION N CML NACH AUTOLOGER KMT 65 4.3.1.4
MRD-VERLAUFSBEOBACHTUNGEN MITTELS WT1-MRNS-EXPRESSION IM KURZINTERVALL
66
IMAGE 3
4.3.2 MRD-VERLAUFSBEOBACHTUNGEN MITTELS WT1-MRNS-EXPRESSLON IM
LIGHTCYCLER-FORMAT 68
4.4 KORRELATION DER WT1-MRNS-EXPRESSLON MIT DEM KLONALEN MARKER BCR-ABL
70 4.5 INTERASSAY-VERGLEICH 71
4.6 MULTIPLEX-PCR IM TAQMAN-FORMAT 71
5 DISKUSSION 72
5.1 METHODENDISKUSSION 72
5.1.1 KLINISCHE ANFORDERUNGEN AN EIN VERFAHREN ZUR
MRD-VERLAUFSBEOBACHTUNG.73 5.1.2 LIMLTATIONEN ALTERNATIVER VERFAHREN
ZUR VERLAUFSDIAGNOSTIK VON MRD 73 5.1.2.1 ZYTOGENETIK 73
5.1.2.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH) 74
5.1.2.3 NORTHERN UND SOUTHERN BLOTTING 74
5.1.2.4 DURCHFLUSSZYTOMETRISCH UNTERSUCHTE LEUKAEMIE-PHAENOTYPEN 75 5.1.3
MOEGLICHKEITEN DER QUANTITATIVEN ANALYSE DER REALTLME-RT-PCR 76 5.1.3.1
VORAUSSETZUNGEN FUER EINE EXAKTE QUANTIFIZIERUNG 76
5.1.3.2 LIMITATION DER QUALITATIVEN RT-PCR UND SEMI-QUANTITATIVEN RT-PCR
77 5.1.3.3 VORTEILE DER QUANTITATIVEN REALTIME-RT-PCR 78
5.1.4 VOR- UND NACHTEILE ZWEIER ALTERNATIVER REALTIME-RT-PCR-VERFAHREN
80 5.1.5 VORTEILE DER PROBENGEWINNUNG AUS PERIPHEREM BLUT 82
5.2 WT1 ALS MOLEKULARER MARKER 82
5.2.1 VERGLEICH VON WT 1 MIT BISLANG ETABLIERTEN KLONALEN MARKERN 83
5.2.2 WT1-UEBEREXPRESSION IN LEUKAEMIEN 84
5.2.3 WT1-EXPRESSION IN NORMALER HAEMATOPOESE 85
5.2.4 WT1 ALS KLONALER MARKER FUER DIE VERLAUFSBEOBACHTUNG VON MRD 86
5.2.5 WT1-UEBEREXPRESSION ALS PROGNOSTISCHER MARKER 88
6 AUSBLICK 90
7 ZUSAMMENFASSUNG 91
8 LITERATUR 93
9 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 119
10 ANHANG 121
10.1 DANKSAGUNG 121 |
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