Untersuchungen zu b1-Integrin [Beta-1-Integrin] als essentiellem Modulator der zellulären Reaktion auf ionisierende Strahlung in Plattenepithelkarzinomzellen:
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| adam_text | Titel: Untersuchungen zu Beta-1-Integrin als essentiellem Modulator der zellulären Reaktion auf ionisieren
Autor: Deuse, Yvonne
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG 1
2 GRUNDLAGEN 4
2.1 Die extrazelluläre Matrix 4
2.2 Zelladhäsion 7
2.2.1 Integrine 7
2.2.2 Aufbau und Funktion von Integrin-Rezeptoren 8
2.2.3 Aktivierung von Integrinen 12
2.2.4 Aufbau und Funktion der fokalen Adhäsionen 13
2.2.5 Integrin-vermittelte Signaltransduktion 15
2.2.5.1 FAK 16
2.2.5.2 AKT 18
2.3 Der Zellzyklus 21
2.3.1 Integrin-abhängige Zellzyklusregulation nach Bestrahlung 24
2.4 Das Plattenepithelkarzinom 26
2.4.1 Die Rolle von Integrinen im Plattenepithelkarzinom 26
2.5 Integrin-vermittelte Resistenz gegenüber ionisierender
Strahlung und Chemotherapeutika 29
3 ZIELSETZUNG DIESER ARBEIT 31
4 MATERIAL 32
4.1 Humane Zelllinien 32
4.2 Medium 33
4.3 Geräte und Hilfsmittel 33
4.3.1 Zellkultur 33
4.3.2 Durchflusszytometer 34
4.3.3 Histologische Färbemethoden 34
4.3.4 Adhäsionsassay 35
4.3.5 Migrationsassay 35
4.3.6 Proliferationsassay 35
4.3.7 Koloniebildungsassay 35
4.3.8 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot 35
4.3.9 Proteinfraktionierung 36
4.3.10 Zellzyklusanalyse 36
4.3.11 Tierversuche 37
4.4 Bestrahlung 37
4.5 Reagenzien und Chemikalien 37
4.5.1 Reagenzien für Zellkultur 37
4.5.2 Reagenzien für Durchflusszytometrie 37
4.5.3 Reagenzien für Histologische Färbemethoden 38
4.5.4 Reagenzien für Adhäsionsassay 40
4.5.5 Reagenzien für Koloniebildungsassay 40
4.5.6 Reagenzien für SDS-Gelelektrophorese und Western Blot 41
4.5.7 Reagenzien für Proteinfraktionierung 46
4.5.8 Reagenzien für Zellzyklusanalyse 48
4.5.9 Matrixproteine 49
4.5.10 Beschichtung mit Matrixproteine 50
4.5.11 Inhibitoren und Antikörper 50
4.5.11.1 Primärantikörper 51
4.5.11.2 Sekundärantikörper 51
4.5.12 Tierversuche 52
4.6 Software 52
5 METHODEN 54
5.1 Zellkultur 54
5.1.1 Auftauen von gefrorenen Zellkulturen 54
5.1.2 Kultivierung von Zellen 54
5.1.3 Einfrieren und Lagerung humaner Zelllinien 55
5.1.4 Zellzahlbestimmung mittels Casy® Cell Counter 55
5.1.5 Gewinnung von AIIB2- und anti-ELAV-Antikörpern 55
5.1.6 Durchflusszytometrie 56
5.1.6.1 Überprüfung der ß1-lntegrin-Oberflächenexpression 56
5.1.6.2 Untersuchungen des Zellzyklus 57
5.1.7 Immunhistologische Färbemethoden 58
5.1.7.1 Herstellung von Gewebeschnitten 58
5.1.7.2 Färben von Gewebeschnitten 58
5.1.7.2.1 Färbung mit Hämalaun-Eosin (HE) 58
5.1.7.2.2 Immunhistologische Färbemethoden 59
5.1.7.2.3 Immunfluoreszenzfärbung 60
5.1.8 Adhäsionsassay 60
5.1.9 Migrationsassay 61
5.1.10 Proliferationsassay 62
5.1.11 Koloniebildungsassay 63
5.1.11.1 Ansatz 63
5.1.12 SDS-Gelelektrophorese und Western Blot 64
5.1.12.1 Ansatz für Zelllysate 64
5.1.12.1.1 Herstellung des Zelllysats 65
5.1.12.2 Proteingewinnung aus Tumoren 65
5.1.12.3 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA-Assay 66
5.1.12.4 Elektrophorese und Proteintransfer 67
5.1.12.5 Detektion 67
5.1.13 Proteinfraktionierung 68
5.2 Tierversuche 69
5.2.1 Tumor 69
5.2.2 Tumorkonstanz 69
5.2.3 Tumorwirt 71
5.2.4 Transplantation 71
5.2.5 Bestimmung der Tumorvolumina 72
5.2.6 Aufbau der Experimente 72
5.2.6.1 Experimentelle Endpunkte 73
5.2.6.1.1 Tumorvolumen und Tumorwachstumsverzögerung 73
5.2.6.1.2 Histologische und molekulare Untersuchungen 74
5.2.7 Bestrahlung 74
5.2.7.1 Bestrahlungsgerät und Dosimetrie 74
5.2.7.2 Ganzkörperbestrahlungen 74
5.2.7.3 Lokale Tumorbestrahlung 75
5.2.7.4 Qualitätskontrolle der lokalen Bestrahlung 75
5.2.8 Toxizitätstest 75
5.2.8.1 Gewichtskontrolle 75
5.2.8.2 Morphologische Untersuchung der Organe 76
6 ERGEBNISSE 77
6.1 Zellkultur 77
6.1.1 ß1-lntegrine in Plattenepithelkarzinomzellen 77
6.1.2 Einfluss von Zell-Matrix-Interaktionen auf Plattenepithelkarzinom-zellen 80
6.1.3 ß1 -Integrin-Inhibition durch den monoklonalen Antikörper-AIIB2 82
6.1.3.1 Modulationen in der ß1-lntegrin-vermittelten Adhäsion durch AIIB2 84
6.1.3.2 Einfluss der ß1 -Integrin-Inhibition auf die Migration 86
6.1.3.3 ß1-Integrin-Inhibition und das klonogene Überleben nach Bestrahlung 86
6.1.3.4 Einfluss der ß1-Integrin-Inhibition auf die Proliferation 89
6.1.3.5 ß1 -Integrin-Inhibition und der Einfluss auf die Aktivierung von Caspase-3 91
6.1.4 Modulationen der ß1-lntegrin-abhängigen Signaltransduktion durch AIIB2 92
6.1.4.1 Die Rolle von ß1-lntegrin-assoziierten Proteinen 94
6.1.4.2 Strahleninduzierte Expressionsmodulationen 96
6.1.5 ß1-lntegrin Inhibition und die Zellzyklusregulation 98
6.1.6 ß1-lntegrin Inhibition in Normalzellen 101
6.2 Tierversuche 103
6.2.1 Lokalisation von ß1-lntegrin im UTSCC-15-Tumor 103
6.2.2 Mitoseaktvität im UTSCC-15-Tumor nach ß1-lntegrin-Hemmung 105
6.2.3 ß1-lntegrin-abhängige Signaltransduktion in UTSCC-15-Tumoren 106
6.2.4 ß1-Integrin-Inhibition und der Einfluss auf das Tumorvolumen 106
6.2.5 ß1-Integrin-Inhibition und der Einfluss auf die Tumorwachstums-verzögerung 108
7 DISKUSSION 110
7.1 Modulationen der zellulären Strahlenantwort durch
ß1-Integrin-Inhibition in vitro 110
7.2 Modulationen der zellulären Strahlenantwort durch
ß1-Integrin-Inhibition in vivo 119
8 ZUSAMMENFASSUNG 123
9 DANKSAGUNG 125
10 LITERATURVERZEICHNIS 127
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