Etablierung einer sondengestützten real time PCR zur absoluten Quantifizierung nukleärer sowie totaler und spezifisch 4977bp-deletierter mitochondrialer DNA:
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2009
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INHALT
1
EINLEITUNG
1
1.1
NUKLEAERE
UND
MITOCHONDRIALE
DNA
1
1.1.1
NUKLEAERE
DNA
(NDNA)
1
1.1.2
MITOCHONDRIEN
UND
DAS
MITOCHONDRIALE
GENOM
(MTDNA)
1
1.1.3
ALTERATIONEN
MITOCHONDRIALER
DNA
UND
DIE
COMMON
3
DELETION
1.2
ZIELSETZUNG
4
2
MATERIAL
UND
METHODEN
6
2.1
METHODEN
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
VON
DNA-MOLEKUELEN
6
2.1.1
KONVENTIONELLE
DNA-QUANTIFIZIERUNGSMETHODEN
6
2.1.2
RELATIVE
QUANTIFIZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
7
2.1.3
ABSOLUTE
QUANTIFIZIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
MITTELS
REALTIME
PCR
8
2.1.3.1.
QUANTIFIZIERUNG
MIT
SYBR
GREEN!
8
2.1.3.2.
QUANTIFIZIERUNG
MIT
SPEZIFISCHEN
SONDEN
8
2.2
PROBENMATERIAL
9
2.2.1
QUANTIFIZIERUNGSSTANDARDS
AUS
ZELLLINIEN
UND
SKELETTMUSKELGEWEBE
10
2.2.2
MAUS
UND
RATTEN-DNA
ZUR
STANDARDHERSTELLUNG
11
2.2.3
PROBEN
AUS
DER
FORENSISCHEN
ROUTINE
12
2.2.4
BLUTPROBEN
AUS
ABSTAMMUNGSGUTACHTEN:
EINSATZ
DER
NEUEN
QUANTIFIZIERUNGSMETHODE
12
2.2.5
BLUTPROBEN
EINER
KLINISCHEN
STUDIE
12
2.2.6
BLUT
UND
SKELETTMUSKELPROBEN
ZUM
VERGLEICH
DER
QUANTIFIZIERUNGSMETHODE
13
2.3
PCR-VORVERSUCHE
UND
AUTOMATISCHE
FRAGMENTANALYSE
13
2.3.1
NACHWEIS
NUKLEAERER
DNA
MITTELS
TELOMERASE,
MIT
DEM
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
UND
MIT
I
SYBR
GREEN
I
14
2.3.2
NACHWEIS
NUKLEAERER
DNA
IN
DER
SYBR
GREEN
I
-
PCR
UND
OPTIMIERUNG
14
2.3.3
NACHWEIS
GESAMTER
MITOCHONDRIALER
DNA
(WILDTYP
MTDNA)
15
2.3.4
NACHWEIS
DELETIERTER
MITOCHONDRIALER
DNA
UND
DUPLEX-
15
PCR
2.3.5
NACHWEIS
DER
WTMTDNA
(WILDTYP
MITOCHONDRIALE
DNA)
UND
DER
DMTDNA
(DELETIERTER
MITOCHONDRIALE
DNA)
MIT
KUERZEREN
PCR-FRAGMENTEN
17
2.3.6
AUTOMATISCHE
FRAGMENTANALYSE
AUF
DEM
ABI
PRISM
GENETIC
ANALYZER
17
2.4
REAL
TIME
PCR-OPTIMIERUNG
AM
ABI
7000
UND
AM
ABI
7300
FAST
REAL
TIME
PCR
SYSTEM
19
2.4.1
PRINZIP
DER
TAQMAN
PCR
19
2.4.2
OPTIMIERUNG
SVERSUCHE
21
2.4.3
UEBERPRUEFUNG
DER
PCR
AUF
PRIMERDIMERE
MITTELS
GELELEKTROPHORESE
UND/ODER
SCHMELZKURVENANALYSE
22
2.5
EINSATZ
VON
STANDARDMOLEKUELEN
ZUR
ABSOLUTEN
QUANTIFIZIERUNG
22
2.5.1
HERSTELLUNG
DER
NUKLEAEREN
STANDARDS
22
2.5.2
HERSTELLUNG
DER
WILDTYP
UND
DELETIONSSPEZIFISCHEN
STANDARDS
23
2.5.3
AUFREINIGUNG
DER
STANDARDS,
AGAROSEGELELEKTROPHORESE
UND
QUANTIFIZIERUNG
AUF
DEM
GELDOCYY
EQ
25
2.5.4
HERSTELLUNG
DER
STANDARDVERDUENNUNGSREIHEN
MIT
FREMD
DNA-HINTERGRUND
27
2.6
QUANTIFIZIERUNG
DER
NUKLEAEREN
UND
MITOCHONDRIALEN
DNA
IN
EINER
REAL
TIME
PCR
UND
NACH
DER
METHODE
VON
WONG
UND
CORTOPASSI
28
II
3
29
ERGEBNISSE
3.1
NACHWEIS
UND
QUANTIFIZIERUNG
DER
NUKLEAEREN
DNA
MITTELS
REAL
TIME
PCR
29
3.1.1
NACHWEIS
DER
NUKLEAEREN
DNA
MIT
DEM
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
29
3.1.2
NACHWEIS
DER
NUKLEAEREN
DNA
MIT
DER
SELBST
ERSTELLTEN
UND
OPTIMIERTEN
SYBR
GREEN
I
REAL
TIME
PCR
30
3.2
3.2.1
OPTIMIERUNG
DER
SONDENGESTUETZTEN
REAL
TIME
PCR
ZUM
NACHWEIS
DER
GESAMTEN
UND
DELETIERTEN
MITOCHONDRIALEN
DNA
DURCH
EINSATZ
VERSCHIEDENER
PCRS
UND
POLYMERASENVERGLEICH
REAL
TIME
PCR
MIT
DEFINIERTER
STANDARD-DNA
UND
32
POLYMERASENVERGLEICH
33
3.2.2
REAL
TIME
PCR
MIT
SKELETTMUSKEL
UND
BLUTPROBEN
UND
POLYMERASENVERGLEICH
34
3.3
NACHWEIS
MITOCHONDRIALER
DNA
IN
EINER
SONDENGESTUETZTEN
REAL
TIME
PCR
37
3.3.1
NACHWEIS
DER
GESAMTEN
MITOCHONDRIALEN
(WTMTDNA)
IN
EINER
SINGLEPLEX-PCR
YY
37
3.3.2
NACHWEIS
DER
SPEZIFISCH
4977BP-DELETIERTEN
MTDNA
(DMTDNA)
IN
EINER
SINGLEPLEX-PCR
38
3.3.3
NACHWEIS
DER
GESAMTEN
UND
DELETIERTEN
MITOCHONDRIALEN
DNA
IN
EINER
DUPLEX-PCR
40
3.3.4
VERGLEICH
DER
NEU
ETABLIERTEN
REAL
TIME
PCR
MIT
DER
KONVENTIONELLEN
DUPLEX-PCR
43
3.4
QUANTIFIZIERUNG
NUKLEAERER
DNA
AUS
BLUTPROBEN
MIT
DEM
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
44
3.5
QUANTIFIZIERUNG
FORENSISCHER
PROBEN
MITTELS
QUANTIFILER
YY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
UND
MIT
SYBR
GREEN
I
45
3.6
EINSATZ
DER
NEUEN
SONDENGESTUETZTEN
REAL
TIME
PCR
ZUR
ANALYSE
DES
WTMTDNA
UND
DMTDNA-GEHALTES
VON
BLUTPROBEN
46
III
3.7
ABSOLUTE
QUANTIFIZIERUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
DNA
IN
DER
REAL
TIME
PCR
UND
NACH
DER
METHODE
VON
WONG
UND
CORTOPASSI
48
4
DISKUSSION
49
4.1
NACHWEIS
DER
NUKLEAEREN
UND
MITOCHONDRIALEN
DNA
IN
DER
REAL
TIME
PCR
49
4.1.1
DURCHFUEHRUNG
DER
REAL
TIME
PCR,
REPRODUZIERBARKEIT
UND
VORTEILE
DER
METHODE
51
4.1.2
NACHTEILE
DER
METHODE
52
4.2
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEAERER
DNA,
WTMT
UND
DMTDNA
AUS
BLUTPROBEN
53
4.2.1
BLUTPROBEN:
QUANTIFIZIERUNG
DER
WT
UND
DMTDNA
53
4.2.2
VERGLEICH
DES
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
MIT
HERKOEMMLICHEN
QUANTIFIZIERUNGSMETHODEN
54
4.2.3
VERGLEICH
VERSCHIEDENER
METHODEN
ZUR
DNA
QUANTIFIZIERUNG
54
4.3
ABSOLUTE
QUANTIFIZIERUNG
DER
WTMTDNA
UND
DER
DMTDNA
55
4.4
FORENSIK:
VERGLEICH
DES
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KITS
MIT
DER
SYBR
GREEN
I
REAL
TIME
PCR
56
5
ZUSAMMENFASSUNG
58
6
ANHANG
60
6.1
VERWENDETE
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
NACH
ART
DER
ANWENDUNG
60
6.2
ALPHABETISCHE
CHEMIKALIENLISTE
61
6.3
ANSATZ
UND
VORBEREITUNG
DER
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN
62
6.4
ABKUERZUNGEN
63
IV
6.5
TABELLEN
UND
ABBILDUNGEN
65
6.6
TABELLEN
ZU
DEN
OPTIMIERUNGSVERSUCHEN
70
6.7
ERGAENZENDE
ABBILDUNGEN
UND
ROHDATEN
ZU
KAPITEL
3
(ERGEBNISSE)
71
6.7.1
PCR-EFFIZIENZEN
UND
KORRELATIONSKOEFFIZIENTEN
DER
REAL
TIME
71
PCR
6.7.2
VERGLEICH
DER
CT-WERTE
DER
REAL
TIME
PCRS
73
6.7.3
ROHDATEN
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
VON
NUKLEAERER
DNA
AUS
BLUTPROBEN
MIT
DEM
QUANTIFILERYY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
(SIEHE
3.4)
74
6.7.4
ROHDATEN
UND
ABBILDUNGEN
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
FORENSISCHER
UND
ANTHROPOLOGISCHER
PROBEN
MITTELS
QUANTIFILER
YY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
(SIEHE
3.5)
77
6.7.5
ROHDATEN
UND
ABBILDUNGEN
ZUR
QUANTIFIZIERUNG
FORENSISCHER
PROBEN
MITTELS
QUANTIFILER
YY
HUMAN
DNA
QUANTIFICATION
KIT
UND
MIT
SYBR
GREEN
I
(SIEHE
3.5)
80
6.7.6
ROHDATEN
ZUR
ABSOLUTEN
QUANTIFIZIERUNG
DER
MITOCHONDRIALEN
DNA
IN
DER
REAL
TIME
PCR
UND
NACH
DER
METHODE
VON
WONG
UND
CORTOPASSI
83
7
LITERATURVERZEICHNIS
85
8
DANKSAGUNG
95
9
LEBENSLAUF
97
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