Adaption humaner epithelialer Tumorzelllinien in 2D- und 3D-Kultur auf serumfreie Kulturbedingungen für einen Einsatz in der Wirkstofftestung:
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| adam_text | Titel: Adaption humaner epithelialer Tumorzelllinien in 2D- und 3D-Kultur auf serumfreie Kulturbedingungen
Autor: Dandorfer, Simone
Jahr: 2009
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
I.Einleitung 1
1.1 Das multizelluläre Tumor-Sphäroid-Modell 1
1.1.1 Charakterisierung multizellulärer Tumor-Sphäroide (MCTS) 5
1.1.2 ?Spheroid-Based-Screen : Einsatz von MCTS im Anti-Tumor- 7
Wirkstoff-Screening
1.1.3 Zytotoxizitätsbestimmungen von MCTS: ?Acid Phosphatase Assay 8
(APH-Assay)
1.2 Zellkultur unter serumfreien Bedingungen und MCTS 11
1.3 Aufgabenstellung und Zielsetzung 12
2. Material und Methoden 14
2.1 Materialien und Geräte 14
2.1.1 Verwendete Tumorzelllinien 14
2.1.2 Zellkulturpuffer und -lösungen 16
2.1.3 Zellkulturmedien 16
2.1.3.1 Serumhaltiges Kulturmedium 16
2.1.3.2 Serumfreie Kulturmedien 16
2.1.4 Chemikalien 17
2.1.5 Verbrauchsmaterialien und Plastikartikel 18
2.1.6 Geräte und Software 19
2.2 Monolayer-Kulturen 20
2.2.1 Zellkulturbedingungen 20
2.2.2 Zelldissoziation und Zellzahlbestimmung 20
2.2.3 Adaption der Zelllinien auf serumfreie Kulturbedingungen 21
2.2.4 Einfrieren von Zelllinien unter serumfreien Kulturbedingungen 22
2.2.5 Einsatz des APH-Assays 22
2.2.5.1 Vorbereitung der Monolayer-Kulturen 22
2.2.5.2 Durchführung des APH-Assays an Monolayer-Kulturen 23
2.3 Sphäroid-Kulturen in ?Liquid-Overiay -Technik 23
2.3.1 Vorbereitung der 96-Well-Mikrotiterplatten 24
2.3.2 Aussaat und Kulturbedingungen 24
Inhaltsverzeichnis
2.3.3 Methoden der Sphäroidanalytik 25
2.3.3.1 Bestimmung von Sphäroiddurchmesser und -volumen 25
2.3.3.2 Darstellung und Analyse des Sphäroidvolumenwachstums 25
2.3.3.3 Sphäroiddissoziation und Zellzahlbestimmung 26
2.3.3.4 Histologische Aufarbeitung von Sphäroiden 27
2.3.4 Einsatz des APH-Assays 28
2.3.4.1 Vorbereitung der Sphäroid-Kulturen 28
2.3.4.2 Durchführung des APH-Assays an MCTS 28
2.4 Sphäroid-Kultur auf ?Low Cell Binding -96-Well-Platten 29
2.5 Behandlung von Monolayer- und Sphäroid-Kulturen mit Wirkstoffen 29
2.5.1 Kontrollsubstanz: Triton X-100 30
2.5.2 Wirkstoffe: 5-FU und Symadex 30
2.5.3 Analyse der Wirkstoff-Effizienz 31
3. Ergebnisse 32
3.1 Zellkultur und Sphäroidbildung unter serumfreien Kulturbedingungen 32
3.1.1 Testung verschiedener serumfreier Kulturmedien 32
3.1.2 Charakterisierung von Monolayer-Kulturen 33
3.1.2.1 Zelllinien der Tumorentität Kolon 33
3.1.2.2 Zelllinien der Tumorentität Mamma 34
3.1.3 Charakterisierung von Sphäroid-Kulturen 35
3.1.3.1 Zelllinien der Tumorentität Kolon 35
3.1.3.2 Zelllinien der Tumorentität Mamma 50
3.2 Sphäroidbildung auf ?Low Cell Binding -96-Well-Platten (Nunc?) 53
3.2.1 Sphäroidbildung auf LCB-Platten unter serumhaltigen 53
Kulturbedingungen
3.2.2 Sphäroidbildung auf LCB-Platten unter serumfreien 55
Kulturbedingungen
3.3 Chemotherapeutische Wirkung unter serumhaltigen vs. 57
serumfreien Kulturbedingungen
3.3.1 Chemotherapeutische Wirkung unter serumhaltigen 58
vs. serumfreien Kulturbedingungen in Monolayer-Kulturen
3.3.2 Chemotherapeutische Wirkung unter serumhaltigen 60
vs. serumfreien Kulturbedingungen in Sphäroid-Kulturen
Inhaltsverzeichnis
3.3.3 Chemotherapeutische Wirkung in Monolayer- 62
vs. Sphäroid-Kultur
3.3.3.1 Serumhaltige Kulturbedingungen 62
3.3.3.2 Serumfreie Kulturbedingungen 64
4. Diskussion 67
4.1 Standardisierung der Kulturbedingungen und Analytik 67
4.1.1 Serumfreie Sphäroidkultivierung 67
4.1.2 Sphäroid-Kultur auf ?Low Cell Binding -Platten 72
4.2 Zytotoxizitäts-A/italitätsbestimmung an MCTS 74
4.3 Einsatzmöglichkeiten des MCTS-Modells in High-Throughput-Screening 78
und experimenteller Therapeutik
5. Zusammenfassung 81
6. Abkürzungsverzeichnis 83
7. Literaturverzeichnis 85
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