Funktionelle Charakterisierung atopischer Haut: Einfluss von dermalen Fibroblasten auf die Ausprägung der atopischen Dermatitis
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| adam_text | Titel: Funktionelle Charakterisierung atopischer Haut
Autor: Kurschat, Nina
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis
1. EINLEITUNG 8
Die atopische Dermatitis.......................................................................................................8
1.1. Klinische Symptome der atopischen Dermatitis.................................................8
1.2. Ursachen und Auslöser der atopischen Dermatitis...........................................10
1.2.1. Hautbarriere............................................................................................................11
1.2.2. Entzündung der Haut..............................................................................................16
1.2.3. Leukemia inhibitory factor (LIF)...........................................................................19
1.3. Therapeutische Behandlung der atopischen Dermatitis...................................21
1.4. Zielsetzung............................................................................................................22
2. MATERIAL 23
2.1. Chemikalien und Puffer.......................................................................................23
2.2. Kits.........................................................................................................................24
2.3. Verwendete Medien..............................................................................................25
2.4. Antikörper.............................................................................................................26
2.5. Primer für die TaqMan? Real Time-PCR.......................................................27
2.6. Verbrauchsmaterialien........................................................................................27
2.7. Verwendete Geräte...............................................................................................28
3. METHODEN 31
3.1. Klinische Studien..................................................................................................31
3.1.1. Studiendesign.........................................................................................................31
3.1.2. Saugblasenentnahme..............................................................................................32
3.2. Nicht-invasive Parameter....................................................................................32
3.2.1. Messung der Hautfeuchte und des transepidermalen Wasserverlusts der Haut.....32
3.2.2. Entnahme von Hautabrissen zur Analyse der Korneozyten...................................33
3.2.3. Lipidanalytik des Stratum corneums......................................................................34
3.2.4. Mikrobiologische Untersuchungen........................................................................35
33. Histologische Untersuchungen............................................................................36
3.3.1. Anfertigung von Gefrierschnitten..........................................................................36
3.3.2. Anfertigung von Paraffinschnitten.........................................................................36
3.3.3. Hämatoxylin-Eosin-Färbung..................................................................................36
5
Inhaltsverzeichnis
3.3.4. Masson s Trichrome Färbung................................................................................37
3.3.5. Immunhistochemische Färbungen..........................................................................37
3.4. Zellkultur..............................................................................................................38
3.4.1. Isolierung von Fibroblasten und Keratinozyten aus Stanzbiopsien.......................38
3.4.2. Kultivierung von Fibroblasten und Keratinozyten.................................................38
3.4.3. Zellzahlbestimmung...............................................................................................39
3.4.4. Kryokonservierung von primären Hautzellen........................................................39
3.5. In vitro Testsysteme zur Wirkstoffevaluierung.................................................40
3.5.1. Epidermales Stammzellmodell...............................................................................40
3.5.2. 3D-Hautmodell.......................................................................................................41
3.6. Biochemische Methoden......................................................................................43
3.6.1. UV-Bestrahlung von primären Zellen....................................................................43
3.6.2. Messung von intrazellulären reaktiven Sauerstoffspezies.....................................43
3.6.3. Messung der Freisetzung von 8-Isoprostan bzw. Prostaglandin E2.......................43
3.6.4. Quantitativer Nachweis von Zytokinen..................................................................44
3.6.5. Zellzahlbestimmung mittels Propidiumjodid.........................................................46
3.7. Molekularbiologische Methoden.........................................................................47
3.7.1. RNA-Isolierung......................................................................................................47
3.7.2. cDNA-Synthese......................................................................................................47
3.7.3. TaqMan* Real Time-PCR......................................................................................47
3.7.4. Expressionsanalysen mittels Microarray...............................................................48
3.8. Bioinformatische Methoden................................................................................50
3.8.1. Schichtdickenvermessungsprogramm (SDV-Programm)......................................50
3.9. Statistische Auswertungen...................................................................................51
4. ERGEBNISSE 52
4.1. Funktionelle Messung der atopischen Hautbarriere........................................52
4.1.1. Messung der Hautfeuchte und des transepidermalen Wasserverlusts....................52
4.1.2. Charakterisierung von atopischen Korneozyten....................................................54
4.1.3. Analyse der extrazellulären Matrix des Stratum corneums...................................55
4.1.4. Vergleichende Analyse der Mikroflora der Haut...................................................57
4.2. Histologische Untersuchungen der atopischen Haut........................................o0
4.2.1. Epidermale Charakteristika der atopischen Haut...................................................60
4.2.2. Dermale Charakteristika der atopischen Haut........................................................66
6
Inhaltsverzeichnis
4.3. Funktionelle Analyse von atopischen Fibroblasten im 3D-Hautmodell..........70
4.3.1. Aufbau des 3D-Hautmodells..................................................................................70
4.3.2. Einfluss von atopischen Fibroblasten auf die Struktur der Epidermis...................72
4.4. In vitro Analysen von atopischen Fibroblasten..................................................75
4.4.1. Oxidativer Stress in Fibroblasten...........................................................................75
4.4.2. Entzündungsmediatoren in Fibroblasten................................................................77
4.4.3. UV-Einfluss auf Entzündungsmediatoren in Fibroblasten.....................................80
4.5. Rolle des Leukemia inhibitory factors (LIF) in der atopischen Haut...............81
4.5.1. Leukemia inhibitory factor in atopischen Fibroblasten..........................................81
4.5.2. Leukemia inhibitory factor in Saugblasenflüssigkeiten.........................................82
4.5.3. Einfluss von LIF auf die Differenzierung der Epidermis.......................................83
4.5.4. Aufhebung des atopischen Phänotyps durch Zugabe von LIF im atopischen
Hautmodell.............................................................................................................85
5. DISKUSSION 87
5.1. Der Einfluss dermaler Fibroblasten bei der Atopischen Dermatitis...............87
5.1.1. Das atopische 3D-Hautmodell...............................................................................89
5.1.2. Der Leukemia inhibitory factor (LIF) ist ein neues, von Fibroblasten sezerniertes,
therapeutisches Zielmolekül zur Modulation der terminalen Differenzierung der
Epidermis beim atopischen Ekzem........................................................................92
6. ZUSAMMENFASSUNG 96
7. ABSTRACT 98
8. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 99
9. ANHANG 101
10. LITERATURVERZEICHNIS 104
11. DANKSAGUNG 115
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