Einfluss des Fas-Fas-Ligand-Systems auf die Aktivierung humaner T-Zellen:
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| adam_text | Titel: Einfluss des Fas-Fas-Ligand-Systems auf die Aktivierung humaner T-Zellen
Autor: Mathew, Biny Ann
Jahr: 2008
Inhaltsverzeichnis i
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung 1-13
1.1 Immunsystem - Zusammensetzung und Funktion 1
1.2 T-Lymphozyten - Reifung und Funktion 3
Mechanismus der TZR/CD3-vermittelten T-Zellaktivierung 4
1.3 Zelltod 6
1.3.1 Nekrose 6
1.3.2 Apoptose 7
1.4 Fas-Ligand - Struktur und Funktion 7
1.4.1 Struktur. 7
1.4.2 Funktion 8
1.4.3 Mechanismus der Apoptoseinduktion 9
1.4.4 Regulation der Transkription und Expression von FasL 10
1.4.5 FasL als Todesfaktor 11
1.4.6 Modulation der T-Zellaktivierung 13
2. Fragestellung 14
3. Material und Methoden 15-32
3.1 Material 15-21
3.1.1 Pufferund Medien für zellbiologische/immunologische Untersuchungen... 15-17
3.1.1.1 Zellen 15
3.1.1.2 Medien 15
3.1.1.3 Zytokine, mitogene Faktoren und weitere Reagenzien 16
3.1.1.4 Antikörper 16
3.1.1.5 Zellseparation. 16
3.1.1.6 Immunfluoreszenzanalyse 17
3.1.1.7 Puffer und Lösungen 17
3.1.2 Puffer und Medien für biochemische Untersuchungen 17-20
3.1.2.1 Proteinnachweis 17
3.1.2.2 Aufreinigung von Fusionsproteinen 18
3.1.2.3 Caspase-Aktivitäts-Nachweis. 18
Inhaltsverzeichnis —__ il
3.1.2.4 SDS-PAGE 19
3.1.3 Membranen und Filter 20
3.1.4 Verbrauchsmaterial 20
3.1.5 Geräte 21
3.2 Methoden 22-32
3.2.1 Zellbiologische Methoden. .22-26
3.2.1.1 Isolierung mononukleärer Zellen aus peripherem Blut
(BuffyCoat) 22
3.2.1.2 Kultivierung von Zellen 22
3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl und Zellvitalität. .23
3.2.1.4 E-Rosettierung. .23
3.2.1.5 Herstellung von Neuraminidase-behandelten Schaferythrozyten.23
3.2.1.6 Isolierung von CD4+-Zellen mittels Magnet-aktivierter
Zellsortierung (MACS) 24
3.2.1.7 Immunfluoreszenzanalyse .25
3.2.2 Durchführung der Versuchsansätze mit frisch isolierten T-Zellen .26-27
3.2.2.1 Bestimmung des Anteils toter Zellen mittels
Propidiumjodid-Färbung 26
3.2.2.2 Proliferationstest(3H-Thymidin-Einbau) .26
3.2.2.3 Analyse der Caspase-Aktivität .27
3.2.3 Biochemischen Methoden 28-32
3.2.3.1 Proteinbestimmung 28
3.2.3.2 Lyse von Zellen 28
3.2.3.3 Herstellung von Fusionsproteinen 28-29
3.2.3.3.1 Bektroporation von HEK-Zellen 28
3.2.3.3.2 Aufreinigung von Fusionsproteinen 29
3.2.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) 29
3.2.3.5 Western-Blot-Analyse 30
3.2.3.6 Immunpräzipitation mit Fc-Fusionsprotein 32
4. Ergebnisse ___ __ 33-54
4.1 Überprüfung der Funktionalität von FasFc- und FasLFc-Fusionsproteinen33
Inhaltsverzeichnis __jii
4.2 Überprüfung der Reinheit der isolierten Zellen 35
4.3 Optimierung der Stimulationsansätze 36
4.4 Plattengebundenes FasFc-Fusionsprotein inhibiert die CD3/CD28-
induzierte T-Zellstimulation 37
4.5 Plattengebundenes FasLFc-Fusionsprotein führt ebenfalls zur
Inhibition der CD3/CD28-induzierten T-Zellstimulation 39
4.6 Fas-Ligation mit anti-Fas Antikörpern führt zu einer verstärkten
CD3/CD28-induziertenT-Zellaktivierung 40
4.7 Einfluss der Fas-Ligation auf den Zelltod 42
4.7.1 Fas-Ligation mit immobilisierten FasLFc-Fusionsproteinen führt
zu keiner gesteigerten Apoptose 43
4.7.2 Kreuzvernetzung von Fas mit anti-Fas Antikörpern löst in
ruhenden und aktivierten T-Zellen keinen vermehrten Zelltod aus....45
4.8 Einfluss des Fas/FasL-Systems auf die Caspase-Aktivität .46
4.8.1 Caspase-Aktivität ist in CD3/CD28-stimulierten CD4+-Zellen bei
zusätzlicher Stimulation mit FasFc- und FasLFc-Fusionsproteinen
vermindert. .47
4.8.2 Verstärkte Caspase-Aktivität in CD3-stimulierten CD4+-Zellen in
Anwesenheit eines agonistischen anti-Fas Antikörpers. 50
4.8.3 Caspase-Inhibitor zVAD blockiert die CD3/CD28-induzierte
T-Zellproliferation, nicht aber die Fas-vermittelte Kostimulation 53
5. Diskussion 55-61
6. Zusammenfassung 62
7. Literaturverzeichnis 63-69
8. Anhang 70-72
8.1 Publikationen 70
8.2 Danksagung 71
8.3 Curriculum Vitae 72
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