Identifizierung und funktionelle Analyse E2 responsiver cis-Sequenzen im MMP-9-Promotor:
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2008
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| adam_text | Inhaltsverzeichnis
Seite
I.Einleitung 9
1.1 Papillomviren °
Q
1.1.1 Taxonomie
1.1.2 Genetische Eigenschaften der Papillomviren 1 °
1.2 Humane Papillomviren: Epidemiologie und Krankheitsbilder 10
1.2.1 Anogenitale Manifestationen der Infektionen mit HPV 10
1.2.2 Kutane Manifestation der Infektion mit humanen Papillomviren 11
1.3 Das CRPV Tiermodell 13
1.4 Das E2 Protein 14
1.5 Hautkarzinogenese
1.5.1 Allgemeine Eibführung in die Tumorentstehung
1.5.2 Signaltransduktionskaskaden
18
1.5.3 Transkriptionsfaktoren und Tumorentstehung
1Q
1.6 Zielsetzung der Doktorarbeit
2. Material und Methoden 20
2.1 Material 20
2.1.1 Bakterien 20
2.1.2 Eukatyonte Zellen 20
2.1.3 Nukleinsäuren 20
2.1.3.1 Oligonukleotide 20
2.1.3.2 Plasmide 23
2.1.3.3 Rekombinante Plasmide 24
2.1.4 GrÖssenmarker 25
2.1.5 Enzyme 26
2.1.5.1 Restriktionsendonukleasen 26
2.1.5.2 Sonstige Enzyme 26
2.1.6 Medien und Puffer 26
2.1.6.1 Medien für Zellkultur 26
2.1.6.2 Medien für Bakterienkultur 27
4
2.1.6.3 Puffer und Lösungen 27
2.1.7 Fertige Reagenzsysteme (Kits) 27
2.1.8 Verbrauchsmaterial 28
2.1.9 Geräteliste 28
2.1.10 Häufig verwendete Abkürzungen 29
2.2 Methoden 32
2.2.1 Bakterienkultur 32
2.2.1.1 Kulturen für Plasmidisolierung 32
2.2.1.2 Herstellung kompetenter Bakterien 32
2.2.1.3 Transformation kompetenter Bakterien 33
2.2.2 Zellkultur 33
2.2.2.1 Kultivierung eukaryoter Zellen 33
2.2.2.2 Einfrieren von Zelten 34
2.2.2.3 Transfektion eukaryoter Zellen 34
2.2.3 Luziferase-Expressionsanalysen 34
2.2.4 DNA-Techniken 35
2.2.4.1 Standardmethoden 35
2.2.4.2 Präparative Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien 36
2.2.4.3 Fragmentelution aus Agarosegelen 36
2.2.4.4 Agarose Gelelektrophorese 36
2.2.4.5 Polymerasekettenreaktion (PCR) 36
2.2.4.6 Ligation von DNA-Fragmenten 37
2.2.4.7 Hybridisierung von Oligonukleotiden zu doppelsträngiger DNA 37
2.2.4.8 DNA-Sequenzierung 38
2.2.4.9 Mutagenese-PCR 39
3. Ergebnisse 4°
3.1 Gezielte Mutagenese in der DANN-Bindungsdomäne von CRPV-E2 40
5
3.2 Klonierung von Luzieferase-Reporterkonstrukten, die MMP-9 Promotor mit
analoge Transkriptionsfaktorbindestellen besitzen 40
3.3 Testung der Aktivierbarkeit der klonierten Reporterkonstrukte durch
MEKK 42
3.4 Testung der Aktivierbarkeit der klonierten Reporterkonstrukte durch das
CRPV-E2 Protein 43
3.5 Testung der Aktivierbarkeit von Reporterkonstrukte mit einer anderen
Nukleotidsequenz für AP-1 und NFkB 44
3.6 Auswirkung der verschiedenen CRPV-E2 Mutanten auf die Aktivierbarkeit
des pAP-1-Luc Reportervektors 45
3.7 Auswirkung von dominant negativen Mutanten des MAPK-
Signaltransduktionsweges auf die Aktivierbarkeit des pAP-1-Luc durch das
CRPV-E2 Protein 47
3.7.1 Überprüfung der Wirkung von dn ERK1 und dn ERK2 in der Zelllinie
CRL6502 47
3.7.2 Überprüfung der Wirkung von dn ERK1 und dn ERK2 auf die
Aktivierbarkeit des pAP-1-Luc Promotors durch das CRPV-2 Protein in der
Zelllinie CRL6502 48
3.7.3 Überprüfung der Wirkung von dn ERK1 und dn ERK2 in der Zelllinie
CRL6502 auf die Aktivierbarkeit des pE2-Luc Promotors durch das CRPV-E2
Protein 49
3.7.4 Überprüfung der Wirkung von dn p38a, dn p38ß, dn p38v und dn p38S in
der Zelllinie CRL6502 50
3.7.5 Überprüfung der Wirkung von dn p38a, dn p38ß, dn p38y und dn p38ö in
der Zelllinie CRL6502 auf die Aktivierbarkeit des pAP-1-Luc Promotors durch
das CRPV-E2 Protein 52
3.7.6 Überprüfung der Wirkung von dn p38a, dn p38ß, dn p38v und dn p386 in
der Zelllinie CRL6502 auf die Aktivierbarkeit des E2-abhängigen Promotors
pE2-Luc durch das CRPV-E2 Protein 53
3.7.7 Überprüfung der Wirkung von dn JNK1 und dn cJun (Tarn 67) in der Zeil-
Linie CRL6502 54
6
3.7.8 Überprüfung der Wirkung von dn c-Jun und dn JNK1 auf die
Aktivierbarkeit des pAP-1-Luc Promotors durch das CRPV-E2 Protein in der
Zelllinie CRL6502 56
3.7.9 Überprüfung der Wirkung von dn c-Jun und dn JNK1 in der Zeil-Linie
CRL6502 auf die Aktivierbarkeit des pE2-Luc Promotors durch das CRPV-E2
Protein 57
3.8 Aktivierbarkeit des pAP-1-Luc Reporterplasmids durch Überstand von
CRPV-E2 infizierten Zellen 59
3.9 Testung anderer Promotoren 60
4. Diskussion 62
4.1 Mögliche Funktion der E2 Expression während der Infektion der
Keratinozyten mit HPV 62
4.2 Differentielle Aktivierung verschiedener AP-1 Reporterplasmide durch das
E2 Protein 63
4.3 Einflussnahme des E2 Proteins auf die Expression des MMP-9
Proteins 64
4.4 Einflussnahme des E2 Proteins auf den NFkB Signaltransduktions-
Weg 64
4.5 Mögliche Rolle des E2 Proteins während der Immunantwort des Wirtes
während der Infektion mit HPV 66
4.6 DNA-Bindefähigkeit des E2 Proteins keine notwendige Voraussetzung für
dessen Modulation der zelleigenen Signaltransduktionswege 66
4.7 Einflussnahme des E2 Proteins auf zelleigene MAPK Signal¬
transduktionswege 67
4.8 Schlussfolgerung und Ausblick 68
5. Zusammenfassung 70
6. Abbildungen und Tabellen 71
6.1 Abbildungen 71
6.2 Tabellen 72
7
7. Literatur 73
8. Danksagung 84
9. Lebenslauf 85
8
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