mRNA-Induktion des inaktivierenden Transkriptionsfaktors klf2 durch bakterielle Pathogene:
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Autor: Zovko, Josip
Jahr: 2009
INHALTSVERZEICHNIS
I. Einleitung 10
1. Die Gattung Yersinia 10
1.1 Yersinia pestis 10
1.2 Yersinia enterocolitica und Yersinia pseudotuberculosis 11
2. Virulenzfaktoren von Yersinia 12
2.1 T3SS (Typ-3-Sekretionssystem) 12
2.2 Yersinia Effektorproteine 13
2.2.1 YopH 13
2.2.2 YopP/J 14
2.2.3 YopE 14
2.2.4 YopO/YpkA 15
2.2.5 YopT 15
2.2.6 YopM 16
3. Staphylococcus aureus 16
3.1 EDIN vermittelte Virulenz von Staphylococcus aureus 18
4. Pseudomonas aeruginosa 18
4.1 ExoS - ein wichtiger Virulenzfaktor von P. aeruginosa 18
5. Salmonella enterica 19
5.1 Virulenzfaktoren von Salmonella enterica Subspezies enterica 20
6. Struktur und Funktion von klf2 21
7. Zielsetzung 22
4
INHALTSVERZEICHNIS _
II. Material und Methoden 23
Ott
1. Materia)
1.1 Bakterienstämme und Antibiotikaresistenzen
1.2 Plasmide
1.3 ZeSHinien
1.4 Primer und Oligonukleotide
1.5 Stocklösungen von Nukleotiden und Primern für PCR 27
1.6 Antikörper 27
1.7 Antibiotika 28
1.8 Nährmedien und Zusätze für Bakterienkulturen 28
1.8.1 LB Medium/ Agar Z8
1.8.2 LB Medium mit 0,3M NaCI z8
1.8.3 BHI (Brain Heart Infusion) 28
1.8.4 Medium zur Induktion der Virutenzproteinexpression bei
Pseudomonas aemginosa 28
1.8.5 Einfriermedium für Bakterienkulturen 29
1.8.6 Stocklösungen für Simulatoren zur Ssoüerung von Übersiandsproteinen
aus Yetsinien 29
1.8.7 SCAgar 29
1.9 Nährmedien und Zusätze für Zellkulturen 29
1.9.1 Allgemeines 29
1.9.2 Zellkulturmedien und-zusätze 29
1.9.3 Einfriermedium für Zelllinien 30
1.10 Chemikalien, Enzyme und Kits 30
1.10.1 Allgemeines 30
1.10.2 Enzyme 30
1.10.3 Kits 31
1.11 Puffer und Lösungen 31
1.11.1 DNA Galetektrophorese 31
1.112 SDS-PAGE (Sodium-Docieoyl-SuffetPofyacryfamidgeleleWrophorese) 31
1.11.3Westemi)Jot 33
1.11.4 Nukteotide für Erststrang cDNA Synthese and PCR 34
5
INHALTSVERZEICHNIS
1.11.5Granulozyteniso!ierung 34
1.11.6 Lymphozytenisolierung 35
1.12 Geräte 35
2. Methoden 36
2.1 Mikrobiologische Methoden 36
2.1.1 Kultivierung von Bakterien 36
2.1.2 Einfrieren von Bakterien 36
2.1.3 Auftauen von Bakterien 37
2.1.4 Messung der optischen Dichte von Bakterien 37
2.1.5 Herstellung elektrokompetenter Bakterien 37
2.1.6 Elektroporation 38
2.2 Zellbiologische Methoden 38
2.2.1 Einfrieren von Zelllinien 38
2.2.2 Auftauen von Zelllinien 38
2.2.3 Zellzahlbestimmung 39
2.2.4 Isolierung von Granulozyten aus humanen Vollblut 39
2.2.5 Isolierung von Lymphozyten aus humanem Vollblut 40
2.3 Infektionsversuche mit Y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis 40
2.3.1 Einstellung der MOI (Multiplizität der Infektion) 40
2.3.2 Infektion verschiedener Zelllinien 41
2.4 Infektionsversuche mit verschiedenen Gram-positiven und Gram¬
negativen Erregern 41
2.4.1 Einstellung der OD (optische Dichte) 41
2.5 Arbeiten mit Proteinen 42
2.5.1 Isolierung von Überstandsproteinen aus Yersinia Kulturen 42
2.5.2 SDS-PAGE mit Färbung nach Coomassie 42
2.5.3 Westernblot 43
2.5.4 Kultivierung von P. aeruginosa für Westernblotdetektion sezernierter
Proteine 44
2.6 Arbeiten mit Nukleinsäuren 44
2.6.1 PCR (Polymerase-Ketten-ReaktJon) 44
2.6.2 Isolierung von RNA aus infizierten Zellen 46
2.6.3 cDNA Synthese für Real-Time-PCR mit Random-Hexameren 47
6
INHALTSVERZEICHNIS
47
2.6.4 Plasmidisolierung
48
2.6.5 Site-Directed-Mutagenesis
III. Ergebnisse 49
1. YopT-vermHtelte Induktion von klf2 mRNA in
verschiedenen Zelltypen 49
1.1 Wß-Induktfon in verschiedenen murinen und humanen Zelllinien 49
1.2 Zusammenfassung 53
2. Nachweis von pYV-Plasmid und Yop Sekretion in
V. pseudbtubercu/osis 53
2.1 Screening der Yersinien auf das Vorhandensein des
pYV Plasmindes mittels PCR 54
2.2 Screening der Yersinien auf Yop-Sekretion mittles SDS-PAGE 54
2.3 Zusammenfassung 55
3. Induktion von klf2 in J774 Mausmakrophagen durch
y. enterocolitica und Y. pseudotuberculosis 55
4. WßMnduktion in J774-Mausmakrophagen durch verschiedene
Gram-positive und Gram-negative Bakterien 58
4.1 M/2-lnduktion in J774-Makrophagen eine Stunde nach Infektion
mit verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien 59
4.2 Wr2-Induktion in J774-Makrophagen zwei Stunden nach Infektion
mit verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien 60
4.3 Wf2-Induktton in J774-Makrophagen vier Stunden nach Infektion
mit verschiedenen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien 61
5. Identifikation Wß-induzisrender bakterieller Toxine 62
5.1 Stspftytococcüs aunaus 63
5.2 Pseudomonas aeruginosa 64
7
INHALTSVERZEICHNIS
5.3 Salmonella Typhimurium 68
IV. Diskussion 72
1. Die Familie der Krüppel-Like-Faktoren 72
2. Die Funktion von Klf2 73
3. Induktion von kH2 durch verschiedene Bakterienarten 76
4. YopT und Wf2-Regulation 76
5. EDIN und M/2-Regulation 77
6. ExoS und MC-Regulation 79
7. Ktf2-Regulation durch einzelne Salmonellentoxine 81
8. Mögliche Mechanismen der klf2 mRNA Expression 84
9. Bedeutung der bakteriell induzierten klf2 Expression
für das Infektionsgeschehen 87
V. Zusammenfassung 90
VI. Abkürzungen 91
VII. Ein-Buchstabenkodierung für Aminosäuren 97
VIII. Anhang (PCR- und SDS-PAGE Gele) 98
IX. Literaturverzeichnis 106
8
INHALTSVERZEICHNIS
X. Danksagung 119
XI. Lebenslauf 120
, Q
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